Hellfeldmikroskopie - Bright-field microscopy

Ein Beispiel für ein Hellfeld- Mikrobild . Dieses Bild zeigt einen Querschnitt des Gefäßgewebes in einem Pflanzenstamm.

Die Hellfeldmikroskopie (BF) ist die einfachste aller Beleuchtungstechniken der optischen Mikroskopie . Die Probenbeleuchtung wird durchgelassenes (dh von unten beleuchtet und von oben betrachtet) weißes Licht , und der Kontrast in der Probe wird durch die Abschwächung des durchgelassenen Lichts in dichten Bereichen der Probe verursacht. Die Hellfeldmikroskopie ist die einfachste einer Reihe von Techniken, die zur Beleuchtung von Proben in Lichtmikroskopen verwendet werden, und ihre Einfachheit macht sie zu einer beliebten Technik. Das typische Erscheinungsbild einer Hellfeldmikroskopie-Aufnahme ist eine dunkle Probe auf hellem Hintergrund, daher der Name.

Lichtweg

Der Strahlengang eines Hellfeldmikroskops ist denkbar einfach, es werden keine zusätzlichen Komponenten über den normalen Lichtmikroskop-Aufbau hinaus benötigt. Der Lichtweg besteht daher aus:

• eine Durchleuchtungslichtquelle, üblicherweise eine Halogenlampe im Mikroskopstativ;
• eine Kondensorlinse , die Licht von der Lichtquelle auf die Probe fokussiert;
• eine Objektivlinse , die Licht von der Probe sammelt und das Bild vergrößert;
• Okulare und/oder eine Kamera zum Betrachten des Probenbildes.

Hellfeldmikroskopie kann kritische oder Köhler-Beleuchtung verwenden , um die Probe zu beleuchten.

Leistung

Die Hellfeldmikroskopie weist bei den meisten biologischen Proben typischerweise einen geringen Kontrast auf , da nur wenige Licht in hohem Maße absorbieren. Eine Färbung ist oft erforderlich, um den Kontrast zu erhöhen, was in vielen Situationen die Verwendung an lebenden Zellen verhindert. Hellfeldbeleuchtung ist sinnvoll für Proben, die eine Eigenfarbe haben, zum Beispiel Chloroplasten in Pflanzenzellen.

• Vergleich von Durchleuchtungstechniken zur Kontrasterzeugung in einer Seidenpapierprobe (1,559 μm/Pixel)
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  Hellfeldbeleuchtung, Proben Kontrast kommt von Absorption von Licht in der Probe

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  Beleuchtung mit kreuzpolarisiertem Licht , Probenkontrast entsteht durch die Rotation von polarisiertem Licht durch die Probe

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  Dunkelfeldbeleuchtung , Probenkontrast kommt von Licht , das von der Probe gestreut wird

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  Phasenkontrastbeleuchtung , Probenkontrast entsteht durch Interferenz unterschiedlicher Lichtwege durch die Probe

Die Hellfeldmikroskopie ist ein Standardverfahren der Lichtmikroskopie, und daher ist die Vergrößerung durch das mit der Wellenlänge des sichtbaren Lichts mögliche Auflösungsvermögen begrenzt .

Vorteile

• Einfache Einrichtung mit nur erforderlicher Grundausrüstung.
• Lebende Zellen können mit Hellfeldmikroskopen gesehen werden.

Einschränkungen

• Sehr geringer Kontrast der meisten biologischen Proben.
• Die praktische Grenze der Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop liegt bei etwa 1300X. Obwohl höhere Vergrößerungen möglich sind, wird es mit zunehmender Vergrößerung immer schwieriger, die Bildschärfe beizubehalten.
• Geringe scheinbare optische Auflösung aufgrund der Unschärfe des unscharfen Materials.
• Proben, die von Natur aus farblos und transparent sind, können nicht gut gesehen werden, zB viele Arten von Säugerzellen. Diese Proben müssen oft vor der Betrachtung gefärbt werden. Proben, die eine eigene Farbe haben, können ohne Präparation gesehen werden, zB die Beobachtung von zytoplasmatischem Streaming in Chara- Zellen.

Verbesserungen

• Reduzieren oder Erhöhen der Menge der Lichtquelle durch die Irisblende .
• Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs und eines speziellen Immersionsöls, das auf eine Glasabdeckung über der Probe aufgetragen wird. Immersionsöl hat die gleiche Lichtbrechung wie Glas und verbessert die Auflösung der beobachteten Probe.
• Anwendung von Probenfärbemethoden zur Verwendung in der Mikrobiologie , wie einfache Färbungen ( Methylenblau , Safranin , Kristallviolett ) und Differentialfärbungen (Negativfärbungen, Flagellenfärbungen, Endosporenfärbungen).
• Verwendung eines Farbfilters (normalerweise blau) oder eines Polarisationsfilters an der Lichtquelle, um Merkmale hervorzuheben, die unter weißem Licht nicht sichtbar sind. Der Einsatz von Filtern ist besonders bei Mineralproben sinnvoll .

Verweise

1. Fortschrittliche Lichtmikroskopie vol. 1 Prinzipien und grundlegende Eigenschaften von Maksymilian Pluta, Elsevier (1988)
2. Fortschrittliche Lichtmikroskopie vol. 2 Spezialisierte Methoden von Maksymilian Pluta, Elsevier (1989)
3. Einführung in die Lichtmikroskopie von S. Bradbury, B. Bracegirdle, BIOS Scientific Publishers (1998)
4. Mikrobiologie: Prinzipien und Untersuchungen von Jacquelyn G. Black, John Wiley & Sons, Inc. (2005)
5. Mikroskopie und Bildgebungsliteratur

Anmerkungen