Cas9 - Cas9

CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9
Kristallstruktur von Cas9 im Komplex mit Leit-RNA und Ziel-DNA.jpg
Kristallstruktur von S. pyogenes Cas9 im Komplex mit sgRNA und ihrer Ziel-DNA bei 2.5 A Auflösung.
Bezeichner
Organismus Streptococcus pyogenes M1
Symbol cas9
Alt. Symbole SpCas9
Entrez 901176
PDB 4OO8
RefSeq (mRNA) NC_002737.2
RefSeq (Schutz) NP_269215.1
UniProt Q99ZW2
Andere Daten
EG-Nummer 3.1.-.-
Chromosom Genomik: 0,85 - 0,86 Mb
Cas9
Bezeichner
Symbol ?
InterPro IPR028629

Cas9 ( C RISPR als vergesellschafteten Protein 9 , früher Cas5, CSN1 oder Csx12 genannt) a 160 Kilodalton - Protein , das in der immunologischen Abwehr bestimmter Bakterien gegen eine wichtige Rolle spielt , DNA - Viren und Plasmide , und ist in stark ausgelasteten gentechnologische Anwendungen. Seine Hauptfunktion besteht darin, DNA zu schneiden und dadurch das Genom einer Zelle zu verändern. Die Genome Editing- Technik CRISPR-Cas9 trug wesentlich zur Verleihung des Nobelpreises für Chemie im Jahr 2020 an Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna bei .

Technisch gesehen ist Cas9 ein duales RNA- gesteuertes DNA- Endonuklease- Enzym , das mit dem adaptiven Immunsystem Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ( CRISPR ) in Streptococcus pyogenes assoziiert ist . S. pyogenes verwendet CRISPR zum Speichern und Cas9, um später fremde DNA abzufragen und zu spalten, wie beispielsweise eindringende Bakteriophagen- DNA oder Plasmid-DNA. Cas9 führt diese Abfrage durch, indem es fremde DNA abwickelt und nach Stellen sucht, die komplementär zur 20 Basenpaar-Spacer-Region der Leit- RNA sind . Wenn das DNA-Substrat zur Leit-RNA komplementär ist, spaltet Cas9 die eindringende DNA. In diesem Sinne weist der CRISPR-Cas9-Mechanismus eine Reihe von Parallelen zum RNA-Interferenzmechanismus (RNAi) in Eukaryoten auf.

Abgesehen von seiner ursprünglichen Funktion in der bakteriellen Immunität wurde das Cas9-Protein stark als Genom-Engineering-Tool verwendet, um ortsgerichtete Doppelstrangbrüche in der DNA zu induzieren. Diese Brüche können in vielen Labormodellorganismen zur Geninaktivierung oder zur Einführung heterologer Gene durch nicht-homologe Endverbindung bzw. homologe Rekombination führen . Neben Zinkfinger-Nukleasen und Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN)-Proteinen entwickelt sich Cas9 zu einem wichtigen Werkzeug im Bereich der Genom-Editierung.

Cas9 hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, da es nahezu jede zur Leit-RNA komplementäre Sequenz spalten kann. Da die Zielspezifität von Cas9 von der Leit-RNA:DNA-Komplementarität und nicht von Modifikationen des Proteins selbst (wie TALENs und Zinkfingern ) herrührt, ist die Entwicklung von Cas9 für das Targeting neuer DNA unkompliziert. Versionen von Cas9 dass binden , aber nicht spalten kognaten DNA verwendet werden kann transkriptionale zu lokalisieren Aktivator oder Repressoren an spezifischen DNA - Sequenzen zu steuern , um die transkriptionale Aktivierung und Repression. Natives Cas9 benötigt eine Leit-RNA, die aus zwei unterschiedlichen RNAs besteht, die assoziieren – der CRISPR-RNA (crRNA) und der transaktivierenden crRNA ( tracrRNA ). Das Cas9-Targeting wurde durch die Entwicklung einer chimären Single Guide RNA (chiRNA) vereinfacht. Wissenschaftler haben vorgeschlagen, dass Cas9-basierte Gene Drives in der Lage sein könnten, das Genom ganzer Populationen von Organismen zu bearbeiten. 2015 wurde Cas9 zum ersten Mal verwendet, um das Genom menschlicher Embryonen zu verändern.

CRISPR-vermittelte Immunität

Um in einer Vielzahl von herausfordernden, unwirtlichen Lebensräumen zu überleben, die mit Bakteriophagen gefüllt sind , haben Bakterien und Archaeen Methoden entwickelt, um räuberischen Viren auszuweichen und sie abzuwehren . Dazu gehört das CRISPR-System der adaptiven Immunität. In der Praxis wirken CRISPR/Cas-Systeme als selbstprogrammierbare Restriktionsenzyme. CRISPR-Loci bestehen aus kurzen, palindromischen Wiederholungen, die in regelmäßigen Abständen auftreten und aus abwechselnden CRISPR-Wiederholungen und variablen CRISPR-Spacern zwischen 24-48 Nukleotiden Länge bestehen. Diese CRISPR-Loci werden normalerweise von benachbarten CRISPR-assoziierten (cas)-Genen begleitet. Im Jahr 2005 wurde von drei separaten Gruppen entdeckt, dass die Spacer-Regionen zu fremden DNA-Elementen, einschließlich Plasmiden und Viren, homolog waren. Diese Berichte lieferten den ersten biologischen Beweis dafür, dass CRISPRs als Immunsystem fungieren könnten.

Cas9 wurde oft als Werkzeug zur Genom-Editierung verwendet. Cas9 wurde in den jüngsten Entwicklungen verwendet, um Viren daran zu hindern, die DNA von Wirten zu manipulieren. Da das CRISPR-Cas9 aus bakteriellen Genomsystemen entwickelt wurde, kann es verwendet werden, um auf das genetische Material von Viren zu zielen. Die Verwendung des Enzyms Cas9 kann eine Lösung für viele Virusinfektionen sein. Cas9 besitzt die Fähigkeit, auf bestimmte Viren zu zielen, indem es auf bestimmte Stränge der viralen genetischen Information abzielt. Genauer gesagt zielt das Enzym Cas9 auf bestimmte Abschnitte des viralen Genoms ab, die das Virus daran hindern, seine normale Funktion auszuführen. Cas9 wurde auch verwendet, um den schädlichen DNA- und RNA-Strang zu zerstören, der Krankheiten und mutierte DNA-Stränge verursacht. Cas9 hat sich bereits als vielversprechend erwiesen, die Auswirkungen von HIV-1 zu unterbrechen. Es wurde gezeigt, dass Cas9 die Expression der langen terminalen Wiederholungen in HIV-1 unterdrückt. Bei der Einführung in das HIV-1-Genom hat Cas9 die Fähigkeit gezeigt, Stränge von HIV-1 zu mutieren. Cas9 wurde auch bei der Behandlung von Hepatitis b verwendet, indem auf die Enden bestimmter langer terminaler Wiederholungen im viralen Genom von Hepatitis b gezielt wird. Cas9 wurde verwendet, um die Mutationen zu reparieren, die bei Mäusen Katarakte verursachen.

Abb. 2: Die Stadien der CRISPR-Immunität

CRISPR-Cas-Systeme werden in drei Haupttypen (Typ I, Typ II und Typ III) und zwölf Subtypen unterteilt, die auf ihrem genetischen Inhalt und strukturellen Unterschieden basieren. Die wichtigsten definierenden Merkmale aller CRISPR-Cas-Systeme sind jedoch die cas-Gene und ihre Proteine: cas1 und cas2 sind universell für alle Typen und Subtypen, während cas3 , cas9 und cas10 Signaturgene für Typ I, Typ II und Typ III sind , bzw.

CRISPR-Cas-Abwehrstadien

Anpassung

Die Adaption beinhaltet die Erkennung und Integration von Spacern zwischen zwei benachbarten Repeats im CRISPR-Locus. Der „Protospacer“ bezeichnet die Sequenz auf dem viralen Genom, die dem Spacer entspricht. In der Nähe des Protospacers existiert ein kurzer Abschnitt konservierter Nukleotide, der als Protospacer-Advantage-Motiv (PAM) bezeichnet wird. Das PAM ist ein Erkennungsmotiv, das verwendet wird, um das DNA-Fragment zu erhalten. Beim Typ II erkennt Cas9 das PAM während der Adaption, um die Übernahme von funktionellen Spacern zu gewährleisten.

CRISPR-Verarbeitung/Biogenese

Die CRISPR-Expression umfasst die Transkription eines primären Transkripts, das als CRISPR-RNA (pre-crRNA) bezeichnet wird und vom CRISPR-Locus durch RNA-Polymerase transkribiert wird. Spezifische Endoribonukleasen spalten dann die Prä-crRNAs in kleine CRISPR-RNAs (crRNAs).

Störung/Immunität

Die Interferenz betrifft die crRNAs innerhalb eines Multi-Protein-Komplexes namens CASCADE, der Regionen zum Einfügen komplementärer fremder DNA erkennen und spezifisch Basenpaare bilden kann. Der crRNA-Fremd-Nukleinsäure-Komplex wird dann gespalten, wenn es jedoch Fehlpaarungen zwischen dem Spacer und der Ziel-DNA gibt oder wenn Mutationen in der PAM vorliegen, wird die Spaltung nicht initiiert. Im letzteren Szenario wird die fremde DNA nicht für den Angriff durch die Zelle bestimmt, daher schreitet die Replikation des Virus fort und der Wirt ist nicht immun gegen eine Virusinfektion. Die Interferenzphase kann sich mechanistisch und zeitlich von der CRISPR-Erfassung und -Expression unterscheiden, jedoch müssen für eine vollständige Funktion als Abwehrsystem alle drei Phasen funktionsfähig sein.

Stufe 1: Integration von CRISPR-Abstandshaltern. Protospacer und Protospacer-assoziierte Motive (rot dargestellt) werden am „Leader“-Ende eines CRISPR-Arrays in der Wirts-DNA aufgenommen. Das CRISPR-Array besteht aus Spacer-Sequenzen (in farbigen Kästchen dargestellt), die von Wiederholungen (schwarze Rauten) flankiert werden. Dieser Prozess erfordert Cas1 und Cas2 (und Cas9 bei Typ II), die im Cas-Locus kodiert sind, die sich normalerweise in der Nähe des CRISPR-Arrays befinden.

Stufe 2: CRISPR-Expression. Prä-crRNA wird beginnend in der Leader-Region von der Wirts-RNA-Polymerase transkribiert und dann von Cas-Proteinen in kleinere crRNAs gespalten, die einen einzelnen Spacer und eine partielle Wiederholung enthalten (dargestellt als Haarnadelstruktur mit farbigen Spacern).

Stufe 3: CRISPR-Interferenz. crRNA mit einem Spacer, der eine starke Komplementarität zu der ankommenden Fremd-DNA aufweist, beginnt ein Spaltungsereignis (dargestellt mit einer Schere), das Cas-Proteine ​​erfordert. Die DNA-Spaltung stört die Virusreplikation und verleiht dem Wirt Immunität. Das Interferenzstadium kann sich funktionell und temporär von der CRISPR-Erfassung und -Expression unterscheiden (dargestellt durch die weiße Linie, die die Zelle teilt).

Transkriptionsdeaktivierung mit dCas9

dCas9, auch als Endonuklease-defizientes Cas9 bezeichnet, kann verwendet werden, um die Genexpression zu editieren, wenn es auf die Transkriptionsbindungsstelle des gewünschten Abschnitts eines Gens angewendet wird. Die optimale Funktion von dCas9 wird seiner Wirkungsweise zugeschrieben. Die Genexpression wird gehemmt, wenn keine Nukleotide mehr an die RNA-Kette angefügt werden und daher die Verlängerung dieser Kette beendet wird und dadurch der Transkriptionsprozess beeinflusst wird. Dieser Prozess tritt auf, wenn dCas9 in Massenproduktion hergestellt wird, sodass es über ein sequenzspezifisches Leit-RNA-Molekül jederzeit die meisten Gene beeinflussen kann. Da dCas9 die Genexpression herunterzuregulieren scheint, wird diese Wirkung noch verstärkt, wenn es in Verbindung mit repressiven Chromatin-Modifikator-Domänen verwendet wird. Das dCas9-Protein hat andere Funktionen außerhalb der Regulation der Genexpression. Dem dCas9-Protein kann ein Promotor hinzugefügt werden, der es ihnen ermöglicht, miteinander zu arbeiten, um beim Beginnen oder Stoppen der Transkription an verschiedenen Sequenzen entlang eines DNA-Strangs effizient zu sein. Diese beiden Proteine ​​sind spezifisch, wo sie auf ein Gen einwirken. Dies ist bei bestimmten Arten von Prokaryonten vorherrschend, wenn ein Promotor und dCas9 sich selbst ausrichten, um die Fähigkeit der Verlängerung des Polymers von Nukleotiden zu behindern, die zusammenkommen, um ein transkribiertes DNA-Stück zu bilden. Ohne den Promotor hat das dCas9-Protein alleine oder mit einem Genkörper nicht die gleiche Wirkung.

Bei einer weiteren Untersuchung der Auswirkungen der Repression der Transkription wird H3K27, eine Aminosäurekomponente eines Histons, durch die Interaktion von dCas9 und einem Peptid namens FOG1 methyliert. Im Wesentlichen verursacht diese Wechselwirkung eine Genrepression am C + N-terminalen Abschnitt des Aminosäurekomplexes an der spezifischen Verbindungsstelle des Gens und beendet als Ergebnis die Transkription.

dCas9 erweist sich auch als effizient, wenn es darum geht, bestimmte Proteine ​​​​zu verändern, die Krankheiten verursachen können. Wenn dCas9 an eine Form von RNA namens Guide-RNA anlagert, verhindert es die Vermehrung von sich wiederholenden Codons und DNA-Sequenzen, die für das Genom eines Organismus schädlich sein könnten. Wenn mehrere Wiederholungscodons produziert werden, löst es im Wesentlichen eine Reaktion aus oder rekrutiert eine Fülle von dCas9, um die Überproduktion dieser Codons zu bekämpfen, und führt zum Abschalten der Transkription. dCas9 arbeitet synergistisch mit gRNA und beeinflusst direkt die DNA-Polymerase II durch fortgesetzte Transkription.

Eine weitere Erklärung der Funktionsweise des dCas9-Proteins findet sich in ihrer Nutzung von Pflanzengenomen durch die Regulierung der Genproduktion in Pflanzen, um bestimmte Eigenschaften entweder zu erhöhen oder zu verringern. Das CRISPR-CAS9-System kann Gene entweder hoch- oder herunterregulieren. Die dCas9-Proteine ​​sind Bestandteil des CRISPR-CAS9-Systems und diese Proteine ​​können bestimmte Bereiche eines Pflanzengens unterdrücken. Dies geschieht, wenn dCAS9 an Repressordomänen bindet und im Fall der Pflanzen ein regulatorisches Gen wie AtCSTF64 deaktiviert wird.

Bakterien sind ein weiterer Schwerpunkt der Verwendung von dCas9-Proteinen. Da Eukaryoten einen größeren DNA-Aufbau und ein größeres Genom haben; die viel kleineren Bakterien sind leicht zu manipulieren. Als Ergebnis verwenden Eukaryoten dCas9, um die RNA-Polymerase daran zu hindern, den Prozess der Transkription von genetischem Material fortzusetzen.

Strukturelle und biochemische Studien

Kristallstruktur

Cas9-Struktur
Kristallstruktur des CRISPR-assoziierten Proteins Cas9, basierend auf PDB 5AXW von Nishimasu et al.

Cas9 weist eine zweilappige Architektur auf, wobei die Leit-RNA zwischen dem alpha-helikalen Lappen (blau) und dem Nukleaselappen (cyan, orange und grau) eingebettet ist. Diese beiden Lappen sind durch eine einzelne Brückenhelix verbunden. Im Multidomänen-Nukleaselappen befinden sich zwei Nukleasedomänen, die RuvC (grau), die den Nicht-Ziel-DNA-Strang spaltet, und die HNH-Nukleasedomäne (cyan), die den Ziel-DNA-Strang spaltet. Die RuvC-Domäne wird durch sequentiell ungleiche Stellen kodiert, die in der Tertiärstruktur wechselwirken, um die RuvC-Spaltungsdomäne zu bilden (siehe rechte Abbildung).

Kristallstruktur von Cas9 in der Apo-Form. Die strukturelle Wiedergabe wurde mit der UCSF Chimera-Software durchgeführt.

Ein Schlüsselmerkmal der Ziel-DNA besteht darin, dass sie ein Protospacer-angrenzendes Motiv (PAM) enthalten muss, das aus der Drei-Nukleotid-Sequenz NGG besteht. Diese PAM wird von der PAM-wechselwirkenden Domäne (PI-Domäne, orange) erkannt, die sich in der Nähe des C-terminalen Endes von Cas9 befindet. Cas9 erfährt deutliche Konformationsänderungen zwischen den Zuständen Apo, Leit-RNA-gebundene und Leit-RNA:DNA-gebundene Zustände.

Cas9 erkennt die dem CRISPR-Locus innewohnende Stamm-Schleife- Architektur, die die Reifung des crRNA-tracrRNA- Ribonukleoprotein- Komplexes vermittelt. Cas9 im Komplex mit CRISPR-RNA (crRNA) und transaktivierender crRNA (tracrRNA) erkennt und baut die Ziel-dsDNA weiter ab. In der hier gezeigten Co-Kristallstruktur wird der crRNA-tracrRNA-Komplex durch eine chimäre Single-Guide-RNA (sgRNA, rot) ersetzt, die nachweislich die gleiche Funktion wie der natürliche RNA-Komplex hat. Die mit der Ziel-ssDNA gepaarte sgRNA-Base wird von Cas9 als T-förmige Architektur verankert. Diese Kristallstruktur des DNA-gebundenen Cas9-Enzyms zeigt deutliche Konformationsänderungen im alpha-helikalen Lappen in Bezug auf den Nukleaselappen sowie die Lage der HNH-Domäne. Das Protein besteht aus einem Erkennungslappen (REC) und einem Nukleaselappen (NUC). Alle Regionen außer dem HNH bilden enge Interaktionen miteinander und mit dem sgRNA-ssDNA-Komplex, während die HNH-Domäne wenige Kontakte mit dem Rest des Proteins bildet. In einer anderen im Kristall beobachteten Konformation des Cas9-Komplexes ist die HNH-Domäne nicht sichtbar. Diese Strukturen legen die konformative Flexibilität der HNH-Domäne nahe.

Bis heute wurden mindestens drei Kristallstrukturen untersucht und veröffentlicht. Einer repräsentiert eine Konformation von Cas9 im Apo-Zustand und zwei repräsentieren Cas9 im DNA-gebundenen Zustand.

Wechselwirkungen mit sgRNA

CRISPR/Cas9

Im sgRNA-Cas9-Komplex haben die REC1- und PI-Domänen basierend auf der Kristallstruktur wichtige Kontakte mit dem Rückgrat oder den Basen sowohl in der Wiederholungs- als auch in der Spacer-Region. Mehrere Cas9-Mutanten einschließlich REC1- oder REC2-Domänen-Deletion und Restmutationen in BH wurden getestet. REC1- und BH-verwandte Mutanten zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine geringere oder keine Aktivität, was darauf hindeutet, dass diese beiden Domänen für die sgRNA-Erkennung in der Wiederholungssequenz und die Stabilisierung des gesamten Komplexes entscheidend sind. Obwohl die Wechselwirkungen zwischen der Spacersequenz und Cas9 sowie der PI-Domäne und der Wiederholungsregion weitere Studien erfordern, zeigt der Cokristall eine klare Grenzfläche zwischen Cas9 und sgRNA.

DNA-Spaltung

Frühere Sequenzanalysen und biochemische Studien haben gezeigt, dass Cas9 zwei Nukleasedomänen enthält: eine McrA-ähnliche HNH-Nukleasedomäne und eine RuvC-ähnliche Nukleasedomäne. Diese HNH- und RuvC-ähnlichen Nukleasedomänen sind für die Spaltung der komplementären/Ziel- bzw. nicht-komplementären/Nicht-Ziel-DNA-Stränge verantwortlich. Trotz geringer Sequenzähnlichkeit hat die RNase H-ähnliche Sequenz eine RuvC-Faltung (ein Mitglied der RNase H-Familie) und die HNH-Region faltet sich als T4 Endo VII (ein Mitglied der HNH-Endonuklease-Familie).

Wildtyp- S. pyogenes Cas9 benötigt Magnesium (Mg 2+ ) -Cofaktoren für die RNA-vermittelte DNA-Spaltung; Es wurde jedoch gezeigt, dass Cas9 in Gegenwart anderer zweiwertiger Metallionen unterschiedliche Aktivitätsniveaus aufweist. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Cas9 in Gegenwart von Mangan (Mn 2+ ) zur RNA-unabhängigen DNA-Spaltung fähig ist. Die Kinetik der DNA-Spaltung durch Cas9 war für die wissenschaftliche Gemeinschaft von großem Interesse, da diese Daten Einblicke in die Feinheiten der Reaktion geben. Während gezeigt wurde, dass die Spaltung von DNA durch RNA-gebundenes Cas9 relativ schnell ist ( k ≥ 700 s −1 ), erfolgt die Freisetzung der Spaltungsprodukte jedoch sehr langsam ( t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43- 91 h), was Cas9 im Wesentlichen zu einem Single- Turnover- Enzym macht. Weitere Studien in Bezug auf die Kinetik der Cas9 haben gezeigt , konstruiert Cas9 bei der Verringerung um wirksam zu sein Off-Target - Effekte , die durch die Geschwindigkeit der Reaktion zu modifizieren.

Probleme, die Bakterien bei der Bearbeitung von Cas9 darstellen

Die meisten Archaeen und Bakterien weigern sich hartnäckig, einem Cas9 zu erlauben, ihr Genom zu bearbeiten. Dies liegt daran, dass sie fremde DNA, die sie nicht beeinflusst, in ihr Genom anbringen können. Eine andere Möglichkeit, wie diese Zellen Cas9 trotzen, ist das Verfahren des Restriktionsmodifikationssystems (RM). Wenn ein Bakteriophage in eine Bakterien- oder Archaeenzelle eindringt, wird er vom RM-System angegriffen. Das RM-System schneidet dann die Bakteriophagen-DNA durch Restriktionsenzyme in separate Stücke und verwendet Endonukleasen, um die DNA-Stränge weiter zu zerstören. Dies stellt ein Problem für die Cas9-Editierung dar, da das RM-System auch auf die Fremdgene abzielt, die durch den Cas9-Prozess hinzugefügt werden.

Anwendungen von Cas9 für das Transkriptionstuning

Störung der Transkription durch dCas9

Aufgrund der einzigartigen Fähigkeit von Cas9, an praktisch jede Komplementsequenz in jedem Genom zu binden , wollten die Forscher dieses Enzym verwenden, um die Transkription verschiedener genomischer Loci zu unterdrücken . Um dies zu erreichen, können die beiden entscheidenden katalytischen Reste der RuvC- und HNH-Domäne zu Alanin mutiert werden, wodurch die gesamte Endonukleaseaktivität von Cas9 aufgehoben wird. Das resultierende Protein, das als „totes“ Cas9 oder kurz „dCas9“ bezeichnet wird, kann immer noch fest an dsDNA binden. Diese katalytisch inaktive Cas9-Variante wurde sowohl für mechanistische Studien der Cas9-DNA-Interrogative-Bindung als auch als allgemeiner programmierbarer DNA-bindender RNA-Protein-Komplex verwendet.

Die Wechselwirkung von dCas9 mit Ziel-dsDNA ist so eng, dass Harnstoffprotein- Denaturierungsmittel mit hoher Molarität den dCas9-RNA-Protein-Komplex nicht vollständig vom dsDNA-Ziel abspalten kann. dCas9 wurde mit manipulierten Single Guide RNAs gezielt auf Transkriptionsinitiationsstellen aller Loci ausgerichtet, an denen dCas9 mit RNA-Polymerase an Promotoren konkurrieren kann, um die Transkription zu stoppen. Außerdem kann dCas9 auf die kodierende Region von Loci gerichtet werden, so dass die Hemmung der RNA-Polymerase während der Elongationsphase der Transkription auftritt. Bei Eukaryoten kann das Stummschalten der Genexpression verlängert werden, indem dCas9 auf Enhancer-Sequenzen gerichtet wird, wobei dCas9 den Zusammenbau von Transkriptionsfaktoren blockieren kann, was zum Abschalten der spezifischen Genexpression führt. Darüber hinaus können die für dCas9 bereitgestellten Leit-RNAs so gestaltet werden, dass sie spezifische Fehlpaarungen zu seiner komplementären verwandten Sequenz enthalten, die die Interaktion von dCas9 für seine programmierte verwandte Sequenz quantitativ schwächen, was es einem Forscher ermöglicht, das Ausmaß der Gen-Silencing, das auf ein interessierendes Gen angewendet wird, einzustellen. Diese Technologie ähnelt im Prinzip der RNAi, so dass die Genexpression auf RNA-Ebene moduliert wird. Der dCas9-Ansatz hat jedoch viel Anklang gefunden, da es durch die Verwendung von dCas9 im Vergleich zu RNAi-Screens weniger Off-Target-Effekte und im Allgemeinen größere und reproduzierbarere Silencing-Effekte gibt. Da ferner der dCas9 Ansatz zum Gen - Silencing quantitativ gesteuert werden kann, kann ein Forscher nun genau das Ausmaß steuern , an denen ein Gen von Interesse Verdrängte mehr Fragen über die Genregulation und Gene ermöglicht Stöchiometrie beantwortet werden.

Über die direkte Bindung von dCas9 an transkriptionssensitive Positionen von Loci hinaus kann dCas9 an eine Vielzahl von modulatorischen Proteindomänen fusioniert werden, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Kürzlich wurde dCas9 mit Chromatin- Remodeling-Proteinen (HDACs/HATs) fusioniert, um die Chromatinstruktur um verschiedene Loci herum zu reorganisieren. Dies ist wichtig, um verschiedene eukaryontische Gene von Interesse zu adressieren, da Heterochromatinstrukturen die Cas9-Bindung behindern. Da Cas9 auf Heterochromatin reagieren kann , wird darüber hinaus theoretisiert, dass dieses Enzym weiter zur Untersuchung der Chromatinstruktur verschiedener Loci verwendet werden kann. Darüber hinaus wurde dCas9 in genomweiten Screens der Genrepression eingesetzt. Durch den Einsatz großer Bibliotheken von Guide-RNAs, die Tausende von Genen anvisieren können, wurden genomweite genetische Screens unter Verwendung von dCas9 durchgeführt.

Eine andere Methode, die Transkription mit Cas9 zum Schweigen zu bringen, besteht darin, mRNA-Produkte direkt mit dem katalytisch aktiven Cas9-Enzym zu spalten. Dieser Ansatz wird durch die Hybridisierung von ssDNA mit einer PAM-Komplementsequenz an ssRNA ermöglicht, was eine dsDNA-RNA-PAM-Stelle für die Cas9-Bindung ermöglicht. Diese Technologie bietet die Möglichkeit, endogene RNA-Transkripte in Zellen zu isolieren, ohne dass chemische Modifikationen an RNA- oder RNA-Tagging-Methoden induziert werden müssen.

Transkriptionsaktivierung durch dCas9-Fusionsproteine

Im Gegensatz zu Silencing-Genen kann dCas9 auch zur Aktivierung von Genen verwendet werden, wenn es mit Transkriptions-aktivierenden Faktoren fusioniert wird. Diese Faktoren umfassen Untereinheiten der bakteriellen RNA-Polymerase II und traditionelle Transkriptionsfaktoren in Eukaryoten. Kürzlich wurden auch genomweite Screenings der Transkriptionsaktivierung unter Verwendung von dCas9-Fusionen namens „CRISPRa“ zur Aktivierung durchgeführt.

Siehe auch

Verweise

Weiterlesen

Externe Links

  • Übersicht aller in der PDB verfügbaren Strukturinformationen für UniProt : Q99ZW2 (Streptococcus pyogenes CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9/Csn1) an der PDBe-KB .