Zentrifugation - Centrifugation

Zentrifugation ist ein mechanischer Prozess, bei dem die Zentrifugalkraft genutzt wird , um Partikel nach Größe, Form, Dichte, mittlerer Viskosität und Rotordrehzahl aus einer Lösung zu trennen. Die dichteren Bestandteile des Gemisches wandern von der Achse der Zentrifuge weg , während die weniger dichten Bestandteile des Gemisches zur Achse hin wandern. Chemiker und Biologen können die effektive Gravitationskraft des Reagenzglases erhöhen , damit der Niederschlag (Pellet) schnell und vollständig zum Boden des Röhrchens wandert. Die verbleibende Flüssigkeit, die über dem Niederschlag liegt, wird als Überstand oder Überstand bezeichnet.

Es besteht eine Korrelation zwischen der Größe und Dichte eines Partikels und der Geschwindigkeit, mit der sich das Partikel von einem heterogenen Gemisch trennt, wenn die einzige ausgeübte Kraft die Schwerkraft ist. Je größer die Größe und je größer die Dichte der Partikel ist, desto schneller trennen sie sich aus dem Gemisch. Durch Aufbringen einer größeren effektiven Schwerkraft auf das Gemisch, wie es bei einer Zentrifuge der Fall ist, wird die Trennung der Partikel beschleunigt. Dies ist ideal in Industrie- und Laborumgebungen, da Partikel, die sich über einen langen Zeitraum auf natürliche Weise abscheiden würden, in viel kürzerer Zeit abgetrennt werden können.

Die Zentrifugationsrate wird durch die Winkelgeschwindigkeit angegeben, die normalerweise als Umdrehungen pro Minute (RPM) ausgedrückt wird, oder die Beschleunigung, ausgedrückt als g . Der Umrechnungsfaktor zwischen RPM und g ist abhängig von dem Radius des Zentrifugenrotors . Die Partikel Einschwingzeit Geschwindigkeit in Zentrifugation ist eine Funktion ihrer Größe und Form, Zentrifugalbeschleunigung, der Volumenanteil der Feststoffe, die Dichtedifferenz zwischen den Teilchen und der Flüssigkeit und der Viskosität . Die häufigste Anwendung ist die Abtrennung von Feststoffen aus hochkonzentrierten Suspensionen, die bei der Behandlung von Klärschlämmen zur Entwässerung verwendet wird, wo weniger konsistentes Sediment anfällt.

Das Zentrifugationsverfahren hat eine Vielzahl von industriellen und labortechnischen Anwendungen; Dieses Verfahren dient nicht nur zur Trennung zweier mischbarer Stoffe, sondern auch zur Analyse der hydrodynamischen Eigenschaften von Makromolekülen. Sie ist eine der wichtigsten und am häufigsten verwendeten Forschungsmethoden in der Biochemie , Zell- und Molekularbiologie . In der Chemie- und Lebensmittelindustrie können spezielle Zentrifugen einen kontinuierlichen Strom partikelbeladener Flüssigkeit verarbeiten. Die Zentrifugation ist auch die am häufigsten verwendete Methode zur Urananreicherung , die auf dem geringen Massenunterschied zwischen den Atomen von U-238 und U-235 in Uranhexafluorid- Gas beruht .

Mathematische Formel

In einer flüssigen Suspension fallen viele Partikel oder Zellen aufgrund der Schwerkraft allmählich auf den Boden des Behälters ; jedoch ist die für solche Trennungen benötigte Zeit nicht machbar. Andere Partikel, die sehr klein sind, können in Lösung erst dann isoliert werden, wenn sie einer hohen Zentrifugalkraft ausgesetzt werden . Da die Suspension mit einer bestimmten Geschwindigkeit oder Umdrehungen pro Minute (RPM) gedreht wird, ermöglicht die Zentrifugalkraft den Partikeln, sich radial von der Rotationsachse weg zu bewegen. Die allgemeine Formel zur Berechnung der Umdrehungen pro Minute (RPM) einer Zentrifuge lautet:

${\displaystyle RPM={\sqrt {g \over r}}}$,

wobei g die jeweilige Kraft der Zentrifuge und r den Radius von der Rotormitte zu einem Punkt in der Probe darstellt.

Je nach verwendetem Zentrifugenmodell können jedoch der jeweilige Winkel des Rotors und der Radius variieren, daher ändert sich die Formel. Zum Beispiel hat der Sorvall #SS-34 Rotor einen maximalen Radius von 10,8 cm, daher wird die Formel zu , die sich weiter zu vereinfachen lässt . ${\textstyle RPM=299{\sqrt {g\over r}}}$${\textstyle RPM=91{\sqrt {g}}}$

Im Vergleich zur Schwerkraft wird die Teilchenkraft als „Relative Zentrifugalkraft“ (RCF) bezeichnet. Es ist die senkrechte Kraft, die durch die Rotation auf den Inhalt des Rotors ausgeübt wird, immer relativ zur Erdanziehungskraft, die die Stärke von Rotoren unterschiedlicher Art und Größe misst. Der RCF von 1000 xg bedeutet beispielsweise, dass die Zentrifugalkraft 1000-mal stärker ist als die Erdanziehungskraft. RCF ist abhängig von der Rotationsgeschwindigkeit in U/min und dem Abstand der Partikel vom Rotationszentrum. Die gebräuchlichste Formel zur Berechnung des RCF ist:

${\displaystyle RCF=1.118\times 10^{-5}\times r\times (U/min)^{2}}$,

wo ist eine Konstante; r der in Zentimetern ausgedrückte Radius zwischen der Drehachse und dem Mittelpunkt; und rpm ist die Geschwindigkeit in Umdrehungen pro Minute. ${\textstyle 1.118\times 10^{-5}}$

Historisch wurden viele Trennungen mit einer Geschwindigkeit von 3000 U/min durchgeführt; ein grober Anhaltspunkt für die bei dieser Geschwindigkeit ausgeübte „g“-Kraft ist, den Zentrifugationsradius mit dem Faktor 10 zu multiplizieren, sodass ein Radius von 160 mm ungefähr 1600 x g ergibt. Dies ist ein ziemlich willkürlicher Ansatz, da die angewendete RCF linear vom Radius abhängt, so dass ein 10 % größerer Radius bedeutet, dass bei gleicher Geschwindigkeit eine um 10 % höhere RCF angewendet wird. Grob lässt sich die obige Formel zu , mit einem Fehler von nur 0,62 % , vereinfachen . ${\textstyle RCF=10\times r}$

Zentrifugation in der biologischen Forschung

Mikrozentrifugen

Mikrozentrifugen sind speziell entwickelte Tischmodelle mit leichten, kleinvolumigen Rotoren, die eine sehr schnelle Beschleunigung bis zu ca. 17.000 U/min ermöglichen. Sie sind leichte Geräte, die vor allem für die Kurzzeitzentrifugation von Proben bis ca. 0,2–2,0 mL eingesetzt werden. Aufgrund ihrer geringen Größe sind sie jedoch gut transportabel und können bei Bedarf in einem Kühlraum betrieben werden. Sie können gekühlt werden oder nicht. Die Mikrozentrifuge wird normalerweise in Forschungslabors verwendet, in denen kleine Proben biologischer Moleküle, Zellen oder Kerne für relativ kurze Zeitintervalle einer hohen RCF ausgesetzt werden müssen. Mikrozentrifugen, die für Hochgeschwindigkeitsbetrieb ausgelegt sind, können bis zu 35000 U/min erreichen, was eine RCF von bis zu 30000 × g ergibt und werden als Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifugen bezeichnet.

Zentrifugen mit niedriger Drehzahl

Zentrifugen mit niedriger Drehzahl werden verwendet, um chemische Präzipitate, intakte Zellen (Tier, Pflanzen und einige Mikroorganismen), Zellkerne, Chloroplasten, große Mitochondrien und die größeren Plasmamembranfragmente zu gewinnen. In diesen Zentrifugen werden auch Dichtegradienten zur Reinigung von Zellen gefahren. Ausschwingrotoren werden aufgrund der enormen Flexibilität der Probengröße durch die Verwendung von Adaptern in der Regel sehr häufig verwendet. Diese Maschinen haben maximale Rotordrehzahlen von weniger als 10 000 U/min und reichen von kleinen Tischzentrifugen bis hin zu großen Standzentrifugen.

Hochgeschwindigkeitszentrifugen

Hochgeschwindigkeitszentrifugen werden typischerweise verwendet, um Mikroorganismen, Viren , Mitochondrien , Lysosomen , Peroxisomen und intakte röhrenförmige Golgi-Membranen zu ernten . Der Großteil der einfachen Pelletieraufgaben wird in Festwinkelrotoren ausgeführt. Einige Dichtegradienten-Arbeiten zur Reinigung von Zellen und Organellen können in Ausschwingrotoren oder im Fall von Percoll- Gradienten in Festwinkelrotoren durchgeführt werden. Hochgeschwindigkeits- oder Superspeed-Zentrifugen können größere Probenvolumina verarbeiten, von einigen zehn Millilitern bis hin zu mehreren Litern. Darüber hinaus können mit größeren Zentrifugen auch höhere Winkelgeschwindigkeiten (ca. 30.000 U/min) erreicht werden. Die Rotoren können mit verschiedenen Adaptern geliefert werden, um verschiedene Größen von Reagenzgläsern , Flaschen oder Mikrotiterplatten aufzunehmen .

Ultrazentrifugationen

Die Ultrazentrifugation nutzt die hohe Zentrifugalkraft, um die Eigenschaften biologischer Partikel bei außergewöhnlich hohen Geschwindigkeiten zu untersuchen. Aktuelle Ultrazentrifugen können bis zu 150.000 U/min (entspricht 1.000.000 xg) drehen. Sie werden verwendet, um alle Membranvesikel aus der Plasmamembran, dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und der Golgi-Membran , Endosomen , Ribosomen , ribosomalen Untereinheiten, Plasmiden , DNA , RNA und Proteinen in Festwinkelrotoren zu gewinnen. Im Vergleich zu Mikrozentrifugen oder Hochgeschwindigkeitszentrifugen können Ultrazentrifugen viel kleinere Partikel isolieren und zusätzlich, während Mikrozentrifugen und Superzentrifugen Partikel in Chargen trennen (begrenzte Probenmengen müssen manuell in Reagenzgläsern oder Flaschen gehandhabt werden), können Ultrazentrifugen Moleküle chargenweise trennen oder kontinuierliche Durchflusssysteme.

Die Ultrazentrifugation wird für die Trennung von kinetischen Studien der Makromoleküle/Ligandenbindung, die Trennung verschiedener Lipoproteinfraktionen aus dem Plasma und die Deprotonierung von physiologischen Flüssigkeiten für die Aminosäureanalyse verwendet.

Sie sind die am häufigsten verwendeten Zentrifugen für die Dichtegradienten-Reinigung aller Partikel außer Zellen, und während für diesen Zweck traditionell Schwingbecher verwendet wurden, werden auch Festwinkelrotoren und Vertikalrotoren verwendet, insbesondere für selbsterzeugte Gradienten und Dosen die Trennleistung stark verbessern. Es gibt zwei Arten von Ultrazentrifugen: die analytische und die präparative.

Analytische Ultrazentrifugation

Die analytische Ultrazentrifugation (AUC) kann zur Bestimmung der Eigenschaften von Makromolekülen wie Form, Masse, Zusammensetzung und Konformation verwendet werden. Es ist eine häufig verwendete biomolekulare Analysetechnik zur Bewertung der Probenreinheit, zur Charakterisierung der Auf- und Abbaumechanismen biomolekularer Komplexe , zur Bestimmung der Stöchiometrien von Untereinheiten , zur Identifizierung und Charakterisierung makromolekularer Konformationsänderungen und zur Berechnung von Gleichgewichtskonstanten und thermodynamischen Parametern für die Selbstassoziation und heteroassoziierende Systeme. Analytische Ultrazentrifugen enthalten ein optisches Detektionssystem auf der Grundlage von sichtbarem / ultraviolettem Scanning für die Echtzeitüberwachung des Probenfortschritts während einer Zentrifugation.

Die Proben werden mit einer hochdichten Lösung wie Saccharose , Cäsiumchlorid oder Iodixanol zentrifugiert . Die Lösung mit hoher Dichte kann im gesamten Teströhrchen eine einheitliche Konzentration ("Kissen") oder eine variierende Konzentration (" Gradient ") aufweisen. Moleküleigenschaften können durch Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse oder Sedimentationsgleichgewichtsanalyse modelliert werden. Während des Laufs wandern die Partikel oder Moleküle in Abhängigkeit von ihren physikalischen Eigenschaften und den Eigenschaften der Lösung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Teströhrchen und bilden schließlich ein Pellet am Boden des Röhrchens oder Bänder in verschiedenen Höhen.

Präparative Ultrazentrifugation

Präparative Ultrazentrifugen werden häufig verwendet, um Partikel nach ihrer Dichte zu trennen, dichtere Partikel zu isolieren und/oder zu ernten, um sie im Pellet zu sammeln, und um partikelhaltige Suspensionen zu klären. Manchmal verwenden Forscher auch präparative Ultrazentrifugen, wenn sie die Flexibilität benötigen, den Rotortyp im Instrument zu ändern. Präparative Ultrazentrifugen können mit einer Vielzahl unterschiedlicher Rotortypen ausgestattet werden, die Proben unterschiedlicher Anzahl, in unterschiedlichen Winkeln und mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten schleudern können.

Fraktionierungsprozess

In der biologischen Forschung umfasst die Zellfraktionierung typischerweise die Isolierung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der individuellen Rollen jeder Komponente. Im Allgemeinen wird die Zellprobe in einer Suspension aufbewahrt, die:

• Gepuffert - neutraler pH-Wert, verhindert Schäden an der Struktur von Proteinen, einschließlich Enzymen (die Ionenbindungen beeinträchtigen könnten)
• Isotonisch (mit gleichem Wasserpotential) - dies verhindert Wasseraufnahme oder -verlust durch die Organellen
• Cool – reduziert die Gesamtaktivität des Enzyms, das später im Verfahren freigesetzt wird

Die Zentrifugation ist der erste Schritt bei den meisten Fraktionierungen . Durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit können Zelltrümmer entfernt werden, wobei ein Überstand zurückbleibt, der den Inhalt der Zelle konserviert. Wiederholte Zentrifugation bei fortschreitend höheren Geschwindigkeiten fraktioniert Homogenate von Zellen in ihre Komponenten. Im Allgemeinen gilt, je kleiner die subzelluläre Komponente ist, desto größer ist die Zentrifugalkraft, die erforderlich ist, um sie zu sedimentieren. Die lösliche Fraktion eines Lysats kann dann mit einer Vielzahl von Verfahren weiter in ihre Bestandteile aufgetrennt werden.

Differentialzentrifugation

Die Differentialzentrifugation ist die einfachste Methode der Fraktionierung durch Zentrifugation, die üblicherweise verwendet wird, um in Zellen vorkommende Organellen und Membranen zu trennen. Organellen unterscheiden sich im Allgemeinen in der Dichte in der Größe, was die Verwendung von Differentialzentrifugation und Zentrifugation im Allgemeinen möglich macht. Die Organellen können dann durch Testen auf Indikatoren identifiziert werden, die für die spezifischen Organellen einzigartig sind. Die am weitesten verbreitete Anwendung dieser Technik besteht darin, rohe subzelluläre Fraktionen aus einem Gewebehomogenat wie dem aus Rattenleber herzustellen. Partikel unterschiedlicher Dichte oder Größe in einer Suspension werden unterschiedlich schnell sedimentiert, wobei die größeren und dichteren Partikel schneller sedimentieren. Diese Sedimentationsraten können durch Anwendung der Zentrifugalkraft erhöht werden.

Eine Zellsuspension wird einer Reihe zunehmender Zentrifugalkraftzyklen unterworfen, um eine Reihe von Pellets zu erzeugen, die Zellen mit abnehmender Sedimentationsrate umfassen. Homogenat umfasst Kerne, Mitochondrien, Lysosomen, Peroxisomen, Plasmamembranblätter und eine breite Palette von Vesikeln, die aus einer Reihe von intrazellulären Membrankompartimenten und auch aus der Plasmamembran stammen, typischerweise in einem gepufferten Medium.

Dichtegradientenzentrifugation

Die Dichtegradientenzentrifugation ist bekanntermaßen eines der effizientesten Verfahren zum Trennen von suspendierten Partikeln und wird sowohl als Trenntechnik als auch als Verfahren zur Messung der Dichte von Partikeln oder Molekülen in einem Gemisch verwendet.

Es wird verwendet, um Partikel nach Größe, Form und Dichte zu trennen, indem ein Medium mit abgestuften Dichten verwendet wird. Während einer relativ kurzen oder langsamen Zentrifugation werden die Partikel nach Größe getrennt, wobei größere Partikel weiter sedimentieren als kleinere. Während einer langen oder schnellen Zentrifugation wandern die Partikel zu Stellen im Gradienten, an denen die Dichte des Mediums der Partikeldichte entspricht; (ρp – ρm) → 0. Daher sedimentiert ein kleines, dichtes Partikel anfänglich weniger leicht als ein großes Partikel geringer Dichte. Die großen Partikel erreichen früh ihre Gleichgewichtsdichtelage, während die kleinen Partikel langsam über die große Partikelzone wandern und schließlich tiefer in den Gradienten eine Gleichgewichtslage einnehmen.

Ein Röhrchen weist, nachdem es durch dieses Verfahren zentrifugiert wurde, Partikel in der Reihenfolge der Dichte basierend auf der Höhe auf. Das interessierende Objekt oder Partikel befindet sich an der Position innerhalb der Röhre, die seiner Dichte entspricht. Dennoch sind bei dieser Methode einige nicht ideale Sedimentationen möglich. Das erste potenzielle Problem ist die unerwünschte Aggregation von Partikeln, die jedoch bei jeder Zentrifugation auftreten kann. Die zweite Möglichkeit tritt auf, wenn Lösungströpfchen, die Partikel enthalten, sedimentieren. Dies tritt eher auf, wenn mit einer Lösung gearbeitet wird, bei der eine Suspensionsschicht auf einer dichten Flüssigkeit schwimmt, die tatsächlich einen geringen bis keinen Dichtegradienten aufweist.

Andere Anwendungen

Eine Zentrifuge kann verwendet werden, um kleine Mengen von in Suspension zurückgehaltenen Feststoffen aus Flüssigkeiten zu isolieren, beispielsweise bei der Trennung von Kreidepulver aus Wasser. In der biologischen Forschung kann es zur Reinigung von Säugerzellen, Fraktionierung subzellulärer Organellen, Fraktionierung von Membranvesikeln, Fraktionierung von Makromolekülen und makromolekularen Komplexen usw. verwendet werden. Die Zentrifugation wird in der Lebensmittelindustrie auf vielfältige Weise eingesetzt . In der Milchindustrie wird es zum Beispiel typischerweise bei der Klärung und Entrahmung von Milch , der Extraktion von Rahm, der Herstellung und Rückgewinnung von Kasein , der Käseherstellung , der Entfernung von bakteriellen Verunreinigungen usw. verwendet. Diese Verarbeitungstechnik wird auch bei der Herstellung von Getränken verwendet , Säfte, Kaffee, Tee, Bier, Wein , Sojamilch , Öl- und Fettverarbeitung/Rückgewinnung, Kakaobutter , Zuckerherstellung usw. Es wird auch zur Klärung und Stabilisierung von Wein verwendet .

In forensischen und Forschungslabors kann es zur Trennung von Urin und Blutbestandteilen verwendet werden. Es hilft auch bei der Trennung von Proteinen unter Verwendung von Reinigungstechniken wie Aussalzen , zB Ammoniumsulfatfällung. Die Zentrifugation ist auch eine wichtige Technik in der Abfallbehandlung und eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Schlammentwässerung . Dieser Prozess spielt auch bei der Zyklonabscheidung eine Rolle , bei der Partikel ohne den Einsatz von Filtern aus einem Luftstrom abgeschieden werden . In einem Zyklonsammler bewegt sich Luft auf einer spiralförmigen Bahn. Partikel mit hoher Trägheit werden durch die Zentrifugalkraft abgeschieden, während kleinere Partikel im Luftstrom weiterlaufen.

In geringem Umfang wurden Zentrifugen auch verwendet, um leichtere als Wasser-Verbindungen wie Öl zu isolieren. In solchen Situationen wird der wässrige Austrag am gegenüberliegenden Auslass erhalten, aus dem Feststoffe mit einem spezifischen Gewicht größer als eins die Zielstoffe für die Abtrennung sind.

Geschichte

Bis 1923 war es Theodor Svedberg und seinem Schüler H. Rinde gelungen, großkörnige Sole hinsichtlich ihrer gravitativen Sedimentation zu analysieren. Sole bestehen aus einem Stoff, der gleichmäßig in einem anderen Stoff verteilt ist, auch Kolloid genannt . Sole mit kleineren Körnern, wie solche, die Gold enthalten, konnten jedoch nicht analysiert werden. Um dieses Problem zu untersuchen, entwickelte Svedberg eine analytische Zentrifuge, die mit einem fotografischen Absorptionssystem ausgestattet ist, das eine viel größere Zentrifugalwirkung ausüben würde. Außerdem entwickelte er die notwendige Theorie zur Messung des Molekulargewichts. Während dieser Zeit verlagerte sich Svedbergs Aufmerksamkeit von Gold auf Proteine.

Um 1900 war allgemein anerkannt, dass Proteine ​​aus Aminosäuren bestehen; Ob es sich bei Proteinen jedoch um Kolloide oder Makromoleküle handelt, war noch umstritten. Ein damals untersuchtes Protein war Hämoglobin . Es wurde festgestellt, dass es 712 Kohlenstoff, 1.130 Wasserstoff, 243 Sauerstoff, zwei Schwefelatome und mindestens ein Eisenatom enthält. Dies gab Hämoglobin ein resultierendes Gewicht von ungefähr 16.000 Dalton (Da), aber es war ungewiss, ob dieser Wert ein Vielfaches von eins oder vier war (abhängig von der Anzahl der vorhandenen Eisenatome).

Durch eine Reihe von Experimenten unter Verwendung der Sedimentationsgleichgewichtstechnik wurden zwei wichtige Beobachtungen gemacht: Hämoglobin hat ein Molekulargewicht von 68.000 Da, was darauf hindeutet, dass vier Eisenatome statt eines vorhanden sind, und dass es unabhängig davon, woher das Hämoglobin isoliert wurde, es hatte genau das gleiche Molekulargewicht. Es war beispiellos, dass etwas mit einer so großen Molekülmasse konsistent gefunden werden konnte, unabhängig davon, wo es im Körper entnommen wurde, und begünstigte die Idee, dass Proteine ​​eher Makromoleküle als Kolloide sind. Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurde eine Zentrifuge mit noch höheren Geschwindigkeiten benötigt, und so wurde die Ultrazentrifuge geschaffen, um die Theorie der Sedimentation-Diffusion anzuwenden. Es wurde die gleiche Molekülmasse bestimmt, und das Vorhandensein einer sich ausbreitenden Grenze deutete darauf hin, dass es sich um ein einzelnes kompaktes Teilchen handelte. Eine weitere Anwendung der Zentrifugation zeigte, dass die großen homogenen Partikel unter verschiedenen Bedingungen in diskrete Untereinheiten zerlegt werden konnten. Die Entwicklung der Zentrifugation war ein großer Fortschritt in der experimentellen Proteinwissenschaft.

Linderstorm-Lang entdeckte 1937, dass Dichtegradientenröhren für Dichtemessungen verwendet werden können. Das hat er bei der Arbeit mit dem Kartoffel-Gelb-Zwerg-Virus entdeckt. Diese Methode wurde auch in dem berühmten Experiment von Meselson und Stahl verwendet, in dem sie bewiesen, dass die DNA-Replikation durch die Verwendung verschiedener Stickstoffisotope halbkonservativ ist. Sie verwendeten Dichtegradientenzentrifugation, um zu bestimmen, welches Isotop oder welche Isotope von Stickstoff in der DNA nach Replikationszyklen vorhanden waren.

Siehe auch

• Zentrifuge

Verweise

Quellen