Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie - Differential interference contrast microscopy
Die Differenzial-Interferenzkontrast- ( DIC ) -Mikroskopie , auch bekannt als Nomarski-Interferenzkontrast ( NIC ) oder Nomarski-Mikroskopie , ist eine optische Mikroskopietechnik , die verwendet wird, um den Kontrast in ungefärbten, transparenten Proben zu verbessern . DIC arbeitet nach dem Prinzip der Interferometrie , um Informationen über die optische Weglänge der Probe zu gewinnen, um ansonsten unsichtbare Merkmale zu erkennen. Ein relativ komplexes optisches System erzeugt ein Bild, bei dem das Objekt schwarz bis weiß auf grauem Hintergrund erscheint. Dieses Bild ähnelt dem durch Phasenkontrastmikroskopie erhaltenen Bild, jedoch ohne den hellen Beugungshof. Die Technik wurde 1952 vom polnischen Physiker Georges Nomarski entwickelt .
DIC funktioniert, indem es eine polarisierte Lichtquelle in zwei orthogonal polarisierte, gegenseitig kohärente Teile trennt, die an der Probenebene räumlich verschoben (geschert) und vor der Beobachtung rekombiniert werden. Die Interferenz der beiden Teile bei der Rekombination ist abhängig von ihrem optischen Wegunterschied (dh dem Produkt aus Brechungsindex und geometrischer Weglänge). Durch Hinzufügen einer einstellbaren Offset-Phase, die die Interferenz bei einem optischen Wegunterschied von Null in der Probe bestimmt, ist der Kontrast proportional zum Weglängengradienten entlang der Scherrichtung, was das Aussehen eines dreidimensionalen physikalischen Reliefs entsprechend der Variation der optischen Dichte des Probe, betont Linien und Kanten, liefert aber kein topographisch genaues Bild.
Der Lichtweg
1. Unpolarisiertes Licht tritt in das Mikroskop ein und wird um 45° polarisiert.
- Damit die Technik funktioniert, ist polarisiertes Licht erforderlich.
2. Das polarisierte Licht tritt in das erste Nomarski-modifizierte Wollaston-Prisma ein und wird in zwei um 90° zueinander polarisierte Strahlen aufgeteilt, die Abtast- und Referenzstrahlen.
- Wollaston-Prismen sind eine Art Prisma aus zwei Schichten einer kristallinen Substanz wie Quarz, die aufgrund der Brechungsindexvariation in Abhängigkeit von der Polarisation des Lichts das Licht entsprechend seiner Polarisation aufspaltet. Das Nomarski-Prisma bewirkt, dass die beiden Strahlen außerhalb des Prismenkörpers auf einen Brennpunkt treffen und ermöglicht so eine größere Flexibilität beim Aufstellen des Mikroskops, da das Prisma aktiv fokussiert werden kann.
3. Die beiden Strahlen werden vom Kondensor zum Durchgang durch die Probe fokussiert . Diese beiden Strahlen werden so fokussiert, dass sie durch zwei benachbarte Punkte in der Probe gehen, die etwa 0,2 µm voneinander entfernt sind.
- Die Probe wird effektiv durch zwei kohärente Lichtquellen beleuchtet , eine mit 0°-Polarisation und die andere mit 90°-Polarisation. Diese beiden Beleuchtungen sind jedoch nicht ganz ausgerichtet, da eine etwas gegeneinander versetzt liegt.
4. Die Strahlen wandern durch benachbarte Bereiche der Probe, getrennt durch die Scherung. Die Trennung entspricht normalerweise der Auflösung des Mikroskops. Sie erfahren unterschiedliche optische Weglängen, bei denen sich die Bereiche im Brechungsindex oder in der Dicke unterscheiden. Dies verursacht eine Phasenänderung eines Strahls relativ zum anderen aufgrund der Verzögerung, die die Welle in dem optisch dichteren Material erfährt.
- Der Durchgang vieler Strahlenpaare durch Paare benachbarter Punkte in der Probe (und deren Absorption, Brechung und Streuung durch die Probe) bedeutet, dass ein Bild der Probe nun sowohl von 0°- als auch von 90°-polarisiertem Licht getragen wird. Diese wären, einzeln betrachtet, Hellfeldbilder der Probe, die leicht gegeneinander versetzt sind. Das Licht trägt auch Informationen über das für das menschliche Auge unsichtbare Bild, die Phase des Lichts. Das ist später wichtig. Die unterschiedlichen Polarisationen verhindern an dieser Stelle eine Interferenz zwischen diesen beiden Bildern.
5. Die Strahlen laufen durch das Objektiv und werden für das zweite Nomarski-modifizierte Wollaston-Prisma fokussiert.
6. Das zweite Prisma rekombiniert die beiden Strahlen zu einem bei 135° polarisierten. Die Kombination der Strahlen führt zu Interferenzen , die das Bild an dieser Stelle entsprechend dem optischen Gangunterschied aufhellen oder abdunkeln.
- Dieses Prisma überlagert die beiden Hellfeldbilder und richtet ihre Polarisationen so aus, dass sie interferieren können. Aufgrund des Beleuchtungsversatzes stimmen die Bilder jedoch nicht ganz überein – das bedeutet, dass anstelle einer Interferenz zwischen 2 Lichtstrahlen, die durch denselben Punkt in der Probe hindurchgegangen sind, eine Interferenz zwischen Lichtstrahlen auftritt, die durch benachbarte Punkte gingen, die haben daher eine etwas andere Phase. Da der Phasenunterschied auf den Unterschied in der optischen Weglänge zurückzuführen ist, bewirkt diese Rekombination von Licht eine "optische Differenzierung " der optischen Weglänge, wodurch das gesehene Bild erzeugt wird.
Bild
Bei sehr schräger Beleuchtung wirkt das Bild wie ein dreidimensionales Objekt, das starke helle und dunkle Schatten auf den entsprechenden Gesichtern verursacht. Die Richtung der scheinbaren Beleuchtung wird durch die Orientierung der Wollaston-Prismen definiert.
Wie oben erläutert, wird das Bild aus zwei identischen Hellfeldbildern erzeugt, die leicht versetzt zueinander überlagert werden (typischerweise um 0,2 µm), und die anschließende Interferenz aufgrund der Phasendifferenz, die Phasenänderungen (und damit die optische Weglänge) in ein sichtbares Veränderung in der Dunkelheit. Diese Interferenz kann entweder konstruktiv oder destruktiv sein, wodurch die charakteristische Erscheinung von drei Dimensionen entsteht.
Der typische Phasenunterschied, der die Interferenz verursacht, ist sehr klein und sehr selten größer als 90° (ein Viertel der Wellenlänge). Dies liegt an der Ähnlichkeit des Brechungsindex der meisten Proben und der Medien, in denen sie sich befinden: Beispielsweise hat eine Zelle in Wasser nur einen Brechungsindexunterschied von etwa 0,05. Diese kleine Phasendifferenz ist für die korrekte Funktion von DIC wichtig, denn wenn die Phasendifferenz an der Verbindungsstelle zwischen zwei Substanzen zu groß ist, kann die Phasendifferenz 180° (eine halbe Wellenlänge) erreichen, was zu einer vollständigen destruktiven Interferenz und einer anomalen Dunkelheit führt Region; wenn die Phasendifferenz 360° (eine volle Wellenlänge) erreicht, würde sie eine vollständige konstruktive Interferenz erzeugen, wodurch ein anormaler heller Bereich entsteht.
Das Bild kann angenähert werden (unter Vernachlässigung von Brechung und Absorption aufgrund der Probe und der Auflösungsgrenze der Strahltrennung) als Differenz der optischen Weglänge in Bezug auf die Position über die Probe entlang der Scherung, und somit als Differenz des Brechungsindex (optisch Dichte) der Probe.
Der Kontrast kann über die Offset-Phase eingestellt werden, entweder durch Translation des Nomarski-Prismas des Objektivs oder durch eine Lambda/4-Wellenplatte zwischen Polarisator und Kondensor-Normarski-Prisma (De-Senarmont-Kompensation). Der resultierende Kontrast reicht von Dunkelfeld für Null-Phasenversatz (Intensität proportional zum Quadrat des Scherdifferentials) über das typische Relief, das für eine Phase von ~5–90 Grad zu sehen ist, bis hin zu optischer Färbung bei 360 Grad, wo die ausgelöschte Wellenlänge verschiebt sich mit der Phasendifferenz.
Wenn sequentiell verschobene Bilder kollationiert werden, kann die durch das Objekt eingeführte Phasenverschiebung von unerwünschten nicht-interferometrischen Artefakten entkoppelt werden, was typischerweise zu einer Kontrastverbesserung führt, insbesondere bei trüben Proben.
Anwendungen
DIC wird für die Bildgebung lebender und ungefärbter biologischer Proben verwendet, wie z. B. Abstriche aus einer Gewebekultur oder einzelnen einzelligen Organismen auf Wasserbasis. Seine Auflösung und Klarheit unter solchen Bedingungen sind unter den üblichen optischen Mikroskopietechniken konkurrenzlos.
Ein nicht-biologischer Bereich, in dem DIC verwendet wird, ist die Analyse der Verarbeitung von planaren Silizium-Halbleitern. Die dünnen (typischerweise 100–1000 nm) Filme bei der Siliziumverarbeitung sind oft für sichtbares Licht (zB Siliziumdioxid, Siliziumnitrid und polykristallines Silizium) größtenteils transparent, und Defekte in ihnen oder darauf liegende Verunreinigungen werden besser sichtbar. Dies ermöglicht auch die Bestimmung, ob es sich bei einem Merkmal um eine Vertiefung im Substratmaterial oder um einen Fremdmaterialklecks darüber handelt. Geätzte kristalline Merkmale erhalten unter DIC ein besonders markantes Aussehen.
Die Bildqualität ist unter geeigneten Bedingungen hervorragend in der Auflösung und im Gegensatz zum Phasenkontrast nahezu frei von Artefakten. Die Analyse von DIC-Bildern muss jedoch immer die Orientierung der Wollaston-Prismen und die scheinbare Beleuchtungsrichtung berücksichtigen, da parallel dazu keine Merkmale sichtbar sind. Dies kann jedoch leicht durch einfaches Drehen der Probe und Beobachten von Veränderungen im Bild überwunden werden.
Siehe auch
Verweise
- Murphy, D., Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC) und Modulationskontrastmikroskopie, in Fundamentals of Light Microscopy and Digital Imaging, Wiley-Liss, New York, S. 153–168 (2001).
- Salmon, E. und Tran, P., High-Resolution Video-enhanced differentielle Interferenzkontrast (VE-DIC) Lichtmikroskop., Video Microscopy, Sluder, G. und Wolf, D. (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 153–184 (1998).
- Differenzialer Interferenzkontrast — Referenzen
Externe Links
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