Ektodermspezifikation - Ectoderm specification
Bei Xenopus laevis erfolgt die Spezifikation der drei Keimschichten ( Endoderm , Mesoderm und Ektoderm ) im Blastula- Stadium. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um die Faktoren zu bestimmen, die das Endoderm und das Mesoderm spezifizieren. Andererseits wurden im letzten Jahrzehnt nur wenige Beispiele für Gene beschrieben, die für die Ektodermspezifikation erforderlich sind . Das erste Molekül, von dem festgestellt wurde, dass es für die Spezifikation von Ektoderm erforderlich ist, war die Ubiquitinligase Ektodermin (Ecto, TIF1-γ, TRIM33); Später wurde festgestellt, dass das deubiquitinierende Enzym FAM / USP9x die Auswirkungen der Ubiquitinierung durch Ectodermin in Smad4 überwinden kann (Dupont et al., 2009). Es wurden zwei Transkriptionsfaktoren vorgeschlagen, um die Genexpression von ektodermalen spezifischen Genen zu steuern: POU91 / Oct3 / 4 und FoxIe1 / Xema . Ein neuer für das Ektoderm spezifischer Faktor, XFDL156 , hat sich als wesentlich für die Unterdrückung der Mesodermdifferenzierung von pluripotenten Zellen erwiesen.
Ektodermin und FAM
Biologische Rolle von Ectodermin und FAM
Das Protein Ectodermin, das erstmals in Xenopus- Embryonen identifiziert wurde , fördert das ektodermale Schicksal und unterdrückt die Mesodermbildung, die durch die Signalübertragung von Transforming Growth Factor β (TGFβ) und Bone Morphogenic Proteins (BMP), Mitgliedern der TGFβ-Superfamilie, vermittelt wird. Wenn die TGFβ-Liganden an TGFβ-Rezeptoren binden, bewirken sie die Aktivierung der Signalwandler R-Smads ( Smad2 , Smad3 ). Smad4 bildet mit aktivierten R-Smads einen Komplex und aktiviert die Transkription spezifischer Gene als Reaktion auf das TGFβ-Signal. Der BMP-Weg überträgt seine Signale auf ähnliche Weise, jedoch über andere Arten von R-Smads ( Smad1 , Smad5 und Smad8 ). Der Transkriptionsfaktor Smad4 ist der einzige gemeinsame Mediator, der sowohl zwischen TGFβ- als auch den BMP-Pfaden geteilt wird. Während der Ektodermspezifikation wird die Funktion von Smad4 durch Ubiquitinierung und Deubiquitinierung durch Ektodermin und FAM (Abkürzung für Fat Acets bei Säugetieren) reguliert. Der Ubiquitinierungszustand von Smad4 bestimmt, ob es auf von TGFβ und BMP abgeleitete Signale reagieren kann. Das Gleichgewicht der Aktivität, Lokalisation und des Timings von TGFβ- und BMP-Wandlern, Smad4, FAM und Ectodermin sollte erreicht werden, um die Genexpression von Genen, die für die Keimschichtbildung erforderlich sind, modulieren zu können.
Identifizierung von Ectodermin und FAM
Eine cDNA- Bibliothek aus dem Blastula-Stadium eines Froschembryos wurde in RNA-Expressionsplasmide kloniert, um synthetische mRNA zu erzeugen. Die mRNA wurde dann in einem Vier-Zellen-Stadium in mehrere Xenopus- Embryonen injiziert und in frühen Blastula- Embryonen nach einer Erweiterung der Region des ektodermalen Markers Sox2 und einer Verringerung der Expression des mesodermalen Markers Xbra gesucht . Ectodermin war einer von 50 Klonen, die diesen Phänotyp zeigten, wenn sie in Embryonen injiziert wurden. Die Identifizierung von FAM erfolgte durch ein siRNA- Screening, um Deubiquitinasen zu finden , die die Reaktion auf TGFβ regulieren.
Ektodermin- und FAM-Lokalisierung
Ektodermin-mRNA wird maternal im Tierpol des Eies abgelagert. Im frühen Blastula-Stadium des Embryos bilden Ectodermin-mRNA und -Protein einen Gradienten, der vom Tierpol (höchste Konzentration) bis zur Randzone (niedrigste Konzentration) reicht, um TGFβ- und Knotensignale zu verhindern , die vom Pflanzenpol stammendes Mesoderm induzieren. Ectodermin-mRNA ist an der dorsalen Seite des Embryos angereichert, und am Ende dieses Stadiums verschwindet die Expression allmählich. Smad4 wird von Ectodermin im Zellkern ubiquitiniert und in das Zytoplasma exportiert, wo es von FAM deubiquitiniert werden kann. Auf diese Weise kann Smad4 recycelt und wieder funktionsfähig gemacht werden. Obwohl es in Xenopus kein Expressionsprofil von FAM in frühen Embryonen gibt , wird das FAM-Homolog im Zebrafisch in einem Zwei-Zellen-Stadium ubiquitär exprimiert, aber im Verlauf der Entwicklung wird es nur im kephalen Zentralnervensystem exprimiert.
Ectodermin- und FAM-Funktionen
Ectodermin ist eine Ubiquitin-E3-Ligase, die den TGFβ- und den BMP-Signalweg durch Hemmung von Smad4 über Ubiquitinierung von Lysin 519 und auch durch direkte Bindung an Phospho-Smad2 hemmt. Die Injektion von Ecto-mRNA in die Randzone führt zu einer Expansion des frühen ektodermalen Markers Sox2 und einer Reduktion der mesodermalen Marker (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 und Mixer). Das Gegenteil passiert in Knockdown-Experimenten von Ectodermin unter Verwendung einer Morpholino-Strategie; Embryonen werden empfindlicher gegenüber der Activin-Reaktion, sie zeigen eine Zunahme und Ausdehnung der Expression mesodermaler spezifischer Gene und regulieren die Expression der Neuralplatte und des Epidermis-Markers (Sox2 bzw. Cytokeratin) herunter. In Übereinstimmung mit einer RING-Finger-abhängigen Ubiquitin-Ligase-Aktivität von Ectodermin ist eine Ecto-RING-Finger-Mutante (C97A / C100A) hinsichtlich des Funktionsgewinns inaktiv. Der Funktionsgewinn von FAM erhöht die Reaktionen von BMP und TGFβ und sein Funktionsverlust durch Mutation in einem kritischen Rest für seine Aktivität verursachte die Hemmung der TGFβ-Reaktion.
Erhaltung von Ektodermin und FAM bei anderen Arten
Die molekulare Funktion von menschlichem Ektodermin als negativer Regulator von Smad4 legt nahe, dass diese spezifische Funktion in der Wirbeltierlinie erhalten bleibt. Die Sequenzidentität zwischen FAM-Homologen ist höher als 90%, wenn die Homologen von Xenopus , Zebrafisch, Maus und Mensch verglichen werden , was darauf hindeutet, dass dies auch unter anderen Organismen konserviert sein könnte. In der Tat zeigte die Inaktivierung des Knockout-Gens in Mausembryonen, dass die Funktion von Ektodermin als Inhibitor der TGF-beta-Signalübertragung erhalten bleibt. Embryonen ohne Ektodermin zeigen eine fehlerhafte Entwicklung des anterioren viszeralen Endoderms (AVE), dem ersten Gewebe, das durch TGF-beta-Signale in Mausembryonen induziert wird. In Übereinstimmung mit dem Verlust eines Inhibitors zeigten Ektodermin - / - Embryonen eine vergrößerte AVE-Induktion. Da die AVE eine natürliche Quelle für sekretierte TGF-beta-Antagonisten ist, verursachte diese primäre AVE-Expansion in späteren Stadien sekundär eine Hemmung der extrazellulären TGF-beta-Liganden, was dazu führte, dass Embryonen keine Mesodermentwicklung entwickelten. Dieses Modell wurde durch die Feststellung bestätigt, dass Ektodermin - / - Embryonen durch Senkung der genetischen Dosierung des Haupt-TGF-beta-Liganden des Embryos Nodal in den Wildtyp (normale AVE, normale Mesodermentwicklung) gerettet wurden. Eine weitere Unterstützung einer Rolle als TGF-beta-Inhibitor, die gewebeselektive Deletion von Ektodermin aus dem Epiblasten (von der das Mesoderm, aber nicht das AVE abgeleitet ist), ließ das AVE unberührt, verursachte diesmal jedoch eine Ausdehnung des vorderen mesodermalen Schicksals, was auf eine Zunahme hinweist Reaktionsfähigkeit auf TGF-Beta-Signale. Zusammengenommen bestätigten diese Daten mit genetischen Instrumenten eine zellautonome Rolle für Ektodermin als Inhibitor der Smad4-Reaktionen, die zuvor in Xenopus-Embryonen und menschlichen Zelllinien identifiziert wurden.
FOXI1e
Biologische Rolle von FOXI1e
Während der frühen Entwicklung bei Xenopus aktiviert der Transkriptionsfaktor FoxI1e / Xema die epidermale Differenzierung und unterdrückt endoderm- und mesodermspezifische Gene in Tierkappen (Suri et al., 2005). Es wird vermutet, dass FoxI1e aktiv ist, bevor das Ektoderm in Epidermis und Zentralnervensystem differenziert.
Identifizierung von FoxI1e
Mir et al., 2005, identifizierten FoxI1e (Xema) durch Auswahl von Genen, die im Vergleich zur pflanzlichen Region eines frühen Blastula- Embryos unter mesoderminduzierenden Signalen im Ektoderm herunterreguliert wurden . Es wurde auch eine hohe Expression dieses Gens in Tierkappen in Embryonen beobachtet, denen im Vergleich zum Wildtyp VegT fehlt.
Lokalisierung in der Zelle
FoxI1e-mRNA wird zygot exprimiert (Stadium 8.5) und erreicht zu Beginn der Gastrulation ein höheres Expressionsniveau und behält dieses Niveau in Neurula, Schwanzknospe bis zum frühen Kaulquappenstadium bei. FoxI1e hat ein eigenartiges Mosaik-Expressionsmuster, es wird zuerst im dorsalen Ektoderm exprimiert und während die Gastrula fortschreitet, geht die Expression durch die ventrale Seite und ihre Expression wird auf der dorsalen Seite herunterreguliert, wenn sich die Nervenplatte bildet. FoxI1e ist abhängig von BMP-Signalen im Neurula-Stadium, wodurch die Lokalisierung von FoxI1e auf die ventrale Seite des Ektoderms begrenzt wird.
Proteinfunktion und Regulation
FoxI1e / Xema gehört zur FoxI1-Klasse der Gabelkopf-Transkriptionsfaktor-Familie, von der bekannt ist, dass sie an der Mesodermbildung, der Augenentwicklung und der ventralen Kopfspezifikation beteiligt ist. Es wurde vorgeschlagen, dass Notch und / oder NODAL , die in der Pflanzen- / Mesodermregion des frühen Blastula- Embryos exprimiert werden , möglicherweise die Inhibitoren von FoxI1e sein könnten.
Verlust und Funktionsgewinn
Die Hemmung der FoxI1e-mRNA-Reifung durch ein spleißblockierendes Morpholino zeigt Missbildungen in der Entwicklung der Epidermis und des durchlässigen Systems und reguliert die Ektoderm-spezifischen Gene herunter, während die Überexpression von FoxI1e die Bildung von Mesoderm und Endoderm hemmt. Pflanzliche Strukturen bilden späte Blastula-Massen, die normalerweise zu Endoderm und Mesoderm führen würden. Wenn sie mit FoxI1e-mRNA injiziert werden, können sie ektodermale spezifische Marker (pan-ektodermales E-Cadherin, epitheliales Cytokeratin, Neural Crest Marker Slug und Neural Marker Sox-) exprimieren 2) während endodermale Marker (Endodermin, Xsox17a) in der Expression abnahmen.
XFDL156
Biologische Rolle von XFDL156
Das p53- Protein bindet an die Promotoren früher mesodermaler Gene. p53 ist ein maternal hinterlegtes Transkript, das mit Smad2 einen Transkriptionsfaktorkomplex bildet und die Expression von Genen steuert, die an der Mesoderminduktion und Aktivierung von TGFβ-Zielgenen beteiligt sind. Das in der Tierkappe exprimierte Zink (Zn) -Finger -Kernprotein XFDL159 wirkt als Ektodermfaktor, der das Ektoderm spezifiziert, indem es p53 daran hindert, Gene für die Mesodermdifferenzierung zu aktivieren.
Identifizierung von XFDL156
Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus Tierkappen in einem Stadium von 11,5, kloniert in einen Expressionsvektor und erzeugte mRNA. Die synthetische RNA wurde dann in Embryonen injiziert und die Tierkappen dieser gesammelten Embryonen wurden erhalten und einer Aktivinbehandlung unterzogen. Xbra wurde durch Auswahl des Klons gewonnen, der den mesodermalen Marker Xbra unterdrückt.
Lokalisierung von XFDL156
Da XFDL156 ein Faktor ist, der mit p53 interagiert, befindet sich die Lokalisierung dieses Proteins im Kern (Sasai et al., 2008). Die mRNA von XFDL156 wird maternal abgelagert und dann zygotisch exprimiert. Die Zeitleiste der Genexpression zeigt ein höheres Expressionsniveau in der frühen Gastrula und eine halbe Abnahme der Expression in der Mitte der Gastrula, und im Stadium 20 verblasst die Expression.
Proteinfunktion von XFDL156
Der XFDR-Zinkfinger bindet an die regulatorische Region von p53, die sich an der C-terminalen Domäne befindet, und seine Expression wird durch die Anwesenheit von Aktivin-, FoxI1e- oder XLPOU91-Transkriptionsfaktoren nicht beeinflusst.
Funktionsverlust und Funktionsgewinn in XFDL156
Funktionsverlust durch Morpholino führt zu einer falschen mesodermalen Differenzierung in den ektoedermalen Regionen; Dies wird durch die Desuppression von mesodermalen Markern (Xbra, VegT und Mix.2) verursacht. Funktionsgewinn führt zu einer Abnahme der Expression von mesodermalen Markern.
Konservierung von XFDL-Homologen in anderen Spezies
Die Human- und Maushomologen von XFDR156 können die XFDR-Funktion der Interaktion mit p53 ergänzen und dessen Hemmung als Transkriptionsfaktor hemmen.
Ektoderm-Induktion in der frühen Blastula im Xenopus- Embryo.
