Fluoreszenz-Interferenz-Kontrastmikroskopie - Fluorescence interference contrast microscopy

Die Fluoreszenzinterferenzkontrastmikroskopie (FLIC) ist eine mikroskopische Technik, die entwickelt wurde, um eine z-Auflösung im Nanometerbereich zu erreichen.

FLIC tritt immer dann auf, wenn sich fluoreszierende Objekte in der Nähe einer reflektierenden Oberfläche (zB Si-Wafer) befinden. Die resultierende Interferenz zwischen dem direkten und dem reflektierten Licht führt zu einer doppelten sin 2 -Modulation der Intensität I eines fluoreszierenden Objekts als Funktion des Abstands h über der reflektierenden Oberfläche. Dies ermöglicht die Nanometer-Höhenmessungen .

Das FLIC-Mikroskop ist gut geeignet, um die Topographie einer Membran zu messen, die fluoreszierende Sonden enthält, zB eine künstliche Lipiddoppelschicht oder eine lebende Zellmembran oder die Struktur von fluoreszenzmarkierten Proteinen auf einer Oberfläche.

Optische Theorie von FLIC

Allgemeines Zweischichtsystem

Die der FLIC zugrunde liegende optische Theorie wurde von Armin Lambacher und Peter Fromherz entwickelt. Sie abstammen , eine Beziehung zwischen der beobachteten Fluoreszenzintensität und der Entfernung des Fluorophors von einer reflektierenden Siliciumoberfläche.

Die beobachtete Fluoreszenzintensität, , ist das Produkt aus der Anregungswahrscheinlichkeit pro Zeiteinheit, , und der Wahrscheinlichkeit, ein emittiertes Photon pro Zeiteinheit zu messen, . Beide Wahrscheinlichkeiten sind eine Funktion der Fluorophorhöhe über der Siliziumoberfläche, so dass die beobachtete Intensität auch eine Funktion der Fluorophorhöhe ist. Die einfachste zu betrachtende Anordnung ist ein Fluorophor, eingebettet in Siliziumdioxid (Brechungsindex ) in einem Abstand d von einer Grenzfläche mit Silizium (Brechungsindex ). Der Fluorophor wird durch Licht der Wellenlänge angeregt und emittiert Licht der Wellenlänge . Der Einheitsvektor gibt die Ausrichtung des Übergangs Dipol der Anregung des Fluorophors. ist proportional zur quadrierten Projektion des lokalen elektrischen Feldes , , das die Interferenzeffekte einschließt , auf die Richtung des Übergangsdipols. Das lokale elektrische Feld am Fluorophor wird durch die Interferenz zwischen dem direkt einfallenden Licht und dem von der Siliziumoberfläche reflektierten Licht beeinflusst. Die Interferenz wird durch die Phasendifferenz quantifiziert, die durch den Winkel des einfallenden Lichts in Bezug auf die Normale der Siliziumebene gegeben ist. Die Interferenz moduliert nicht nur , sondern die Siliziumoberfläche reflektiert das einfallende Licht nicht perfekt. Fresnel-Koeffizienten geben die Amplitudenänderung zwischen einer einfallenden und einer reflektierten Welle an. Die Fresnel-Koeffizienten hängen von den Einfallswinkeln und den Brechungsindizes der beiden Medien und der Polarisationsrichtung ab . Die Winkel und können durch das Snellsche Gesetz in Beziehung gesetzt werden . Die Ausdrücke für die Reflexionskoeffizienten sind: TE bezieht sich auf die Komponente des elektrischen Feldes senkrecht zur Einfallsebene und TM auf die parallele Komponente (Die Einfallsebene wird durch die Ebenennormale und die Ausbreitungsrichtung des Lichts definiert). In kartesischen Koordinaten ist das lokale elektrische Feld der Polarisationswinkel des einfallenden Lichts in Bezug auf die Einfallsebene. Die Orientierung des Anregungsdipols ist eine Funktion seines Winkels zur Normalen und azimutal zur Einfallsebene. Die beiden obigen Gleichungen für und können kombiniert werden, um die Wahrscheinlichkeit der Anregung des Fluorophors pro Zeiteinheit anzugeben . Viele der oben verwendeten Parameter würden in einem normalen Experiment variieren. Die Variation der fünf folgenden Parameter sollte in diese theoretische Beschreibung einbezogen werden.










  • Die Kohärenz des Anregungslichts
  • Der Einfallswinkel ( ) des Anregungslichts
  • Polarisationswinkel ( ) des Anregungslichts
  • Der Übergangsdipolwinkel ( ) des Fluorophors
  • Die Wellenlänge des Anregungslichts ( )

Die quadrierte Projektion muss über diese Größen gemittelt werden, um die Anregungswahrscheinlichkeit zu erhalten . Mittelung über die ersten 4 Parameter ergibt

Beispiel für ein FLIC-Intensitätsdiagramm, das die relative Fluoreszenzintensität, gemessen gegen den Abstand des Fluorophors von der reflektierenden Oberfläche, zeigt. Die Peaks haben in einem echten experimentellen Plot möglicherweise nicht die gleiche Höhe

Normalisierungsfaktoren sind nicht enthalten. ist eine Verteilung des Orientierungswinkels der Fluorophor-Dipole. Der Azimutwinkel und der Polarisationswinkel analytisch integriert über, so dass sie nicht mehr in der obigen Gleichung erscheint. Um schließlich die Anregungswahrscheinlichkeit pro Zeiteinheit zu erhalten, wird die obige Gleichung über die Streuung der Anregungswellenlänge integriert, wobei die Intensität und der Extinktionskoeffizient des Fluorophors berücksichtigt werden . Die Berechnungsschritte sind äquivalent zu den obigen Berechnungsschritten, außer dass die Parameterlabels em durch ex und in durch out ersetzt werden . Die resultierende gemessene Fluoreszenzintensität ist proportional zum Produkt aus Anregungswahrscheinlichkeit und Emissionswahrscheinlichkeit




Es ist wichtig anzumerken, dass diese Theorie eine Proportionalitätsbeziehung zwischen der gemessenen Fluoreszenzintensität und dem Abstand des Fluorophors über der reflektierenden Oberfläche bestimmt. Die Tatsache, dass es sich nicht um eine Gleichheitsrelation handelt, wird einen signifikanten Einfluss auf das experimentelle Verfahren haben.

Versuchsaufbau

Als reflektierende Oberfläche wird in einem FLIC-Experiment typischerweise ein Siliziumwafer verwendet. Dann wird eine Oxidschicht auf der Oberseite des Siliziumwafers thermisch aufgewachsen, um als Abstandshalter zu wirken. Oben auf dem Oxid wird die fluoreszenzmarkierte Probe platziert, wie beispielsweise eine Lipidmembran, eine Zelle oder membrangebundene Proteine. Mit dem aufgebauten Probensystem werden lediglich ein Epifluoreszenzmikroskop und eine CCD- Kamera benötigt, um quantitative Intensitätsmessungen durchzuführen.

Dies ist ein Diagramm eines beispielhaften FLIC-Versuchsaufbaus mit Silizium, drei Oxidschichten und einer fluoreszenzmarkierten Lipiddoppelschicht (die gelben Sterne stehen für Fluorophore).

Die Dicke des Siliziumdioxids ist sehr wichtig, um genaue FLIC-Messungen durchzuführen. Wie bereits erwähnt, beschreibt das theoretische Modell die relative Fluoreszenzintensität, gemessen gegen die Fluorophorhöhe. Die Fluorophorposition kann nicht einfach aus einer einzelnen gemessenen FLIC-Kurve abgelesen werden. Das grundlegende Verfahren besteht darin, die Oxidschicht mit mindestens zwei bekannten Dicken herzustellen (die Schicht kann mit photolithographischen Techniken hergestellt und die Dicke durch Ellipsometrie gemessen werden ). Die verwendeten Dicken hängen von der zu messenden Probe ab. Für eine Probe mit einer Fluorophorhöhe im Bereich von 10 nm wäre eine Oxiddicke um 50 nm am besten, da die FLIC-Intensitätskurve hier am steilsten ist und den größten Kontrast zwischen den Fluorophorhöhen erzeugen würde. Oxiddicken über einigen hundert Nanometern könnten problematisch sein, da die Kurve durch polychromatisches Licht und verschiedene Einfallswinkel verwischt wird. Ein Verhältnis der gemessenen Fluoreszenzintensitäten bei unterschiedlichen Oxiddicken wird mit dem vorhergesagten Verhältnis verglichen, um die Fluorophorhöhe über dem Oxid zu berechnen ( ). Die obige Gleichung kann dann numerisch gelöst werden, um zu finden . Unvollkommenheiten des Experiments, wie mangelhafte Reflexion, nicht normaler Lichteinfall und polychromatisches Licht neigen dazu, die scharfen Fluoreszenzkurven zu verwischen. Die Streuung des Einfallswinkels kann durch die numerische Apertur (NA) gesteuert werden . Abhängig von der verwendeten numerischen Apertur liefert das Experiment jedoch eine gute laterale Auflösung (xy) oder eine gute vertikale Auflösung (z), aber nicht beides. Eine hohe NA (~1.0) ergibt eine gute laterale Auflösung, die am besten ist, wenn das Ziel darin besteht, die Topographie mit großer Reichweite zu bestimmen. Eine niedrige NA (~0,001) hingegen ermöglicht eine genaue Messung der z-Höhe, um die Höhe eines fluoreszenzmarkierten Moleküls in einem System zu bestimmen.

Analyse

Beispiel für experimentelle Daten, die für eine fluoreszenzmarkierte Probe über 16 Oxiddicken gesammelt wurden. Das Anpassen der Kurve an die 16 Datenpunkte würde die Höhe der Fluorophore über der Oxidoberfläche ergeben.

Die grundlegende Analyse beinhaltet das Anpassen der Intensitätsdaten an das theoretische Modell, wobei der Abstand des Fluorophors über der Oxidoberfläche ( ) ein freier Parameter ist. Die FLIC-Kurven verschieben sich mit zunehmendem Abstand des Fluorophors über dem Oxid nach links. ist normalerweise der interessierende Parameter, aber oft werden mehrere andere freie Parameter eingeschlossen, um die Anpassung zu optimieren. Normalerweise sind ein Amplitudenfaktor (a) und ein konstanter additiver Term für den Hintergrund (b) enthalten. Der Amplitudenfaktor skaliert die relative Modellintensität und der konstante Hintergrund verschiebt die Kurve nach oben oder unten, um die Fluoreszenz zu berücksichtigen, die aus Bereichen außerhalb des Fokusbereichs, wie der Oberseite einer Zelle, kommt. Gelegentlich darf die numerische Apertur (NA) des Mikroskops ein freier Parameter bei der Anpassung sein. Die anderen Parameter, die in die optische Theorie eingehen, wie unterschiedliche Brechungsindizes, Schichtdicken und Lichtwellenlängen, werden mit einer gewissen Unsicherheit als konstant angenommen. Ein FLIC-Chip kann mit Oxidterrassen von 9 oder 16 verschiedenen Höhen hergestellt werden, die in Blöcken angeordnet sind. Nachdem ein Fluoreszenzbild aufgenommen wurde, ergibt jeder 9- oder 16-Terrassenblock eine separate FLIC-Kurve, die eine eindeutige . Der Durchschnitt wird ermittelt, indem alle Werte zu einem Histogramm zusammengefasst werden. Der statistische Fehler bei der Berechnung von kommt aus zwei Quellen: dem Fehler bei der Anpassung der optischen Theorie an die Daten und der Unsicherheit in der Dicke der Oxidschicht. Systematische Fehler entstehen aus drei Quellen: der Messung der Oxiddicke (normalerweise mit einem Ellipsometer), der Messung der Fluoreszenzintensität mit dem CCD und der Unsicherheit der in der optischen Theorie verwendeten Parameter. Der systematische Fehler wurde auf .

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