Gramm-Fleck - Gram stain

Eine Gram-Färbung von gemischtem Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, grampositive Kokken, in Lila) und Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, gram-negative Bazillen, in Rot), den häufigsten Referenzbakterien für die Gram-Färbung

Gram-Färbung oder Gram-Färbung , auch Gram-Methode genannt , ist eine Färbemethode, die verwendet wird, um Bakterienarten in zwei große Gruppen zu unterscheiden und zu klassifizieren : Gram-positive Bakterien und Gram-negative Bakterien . Der Name stammt von dem dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram , der die Technik entwickelt hat.

Die Gramfärbung unterscheidet Bakterien anhand der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände . Gram-positive Zellen haben eine dicke Peptidoglycanschicht in der Zellwand, die den Primärfarbstoff Kristallviolett behält . Gram-negative Zellen haben eine dünnere Peptidoglycan-Schicht, die es ermöglicht, dass das Kristallviolett bei Zugabe von Ethanol ausgewaschen wird. Sie werden durch die Gegenfärbung rosa oder rot gefärbt , gewöhnlich Safranin oder Fuchsin . Lugolsche Jodlösung wird immer nach Zugabe von Kristallviolett zugegeben, um die Bindung der Färbung an die Zellmembran zu verstärken. Die Gramfärbung ist fast immer der erste Schritt bei der vorläufigen Identifizierung eines bakteriellen Organismus. Obwohl die Gram-Färbung sowohl in klinischen als auch in Forschungsumgebungen ein wertvolles diagnostisches Werkzeug ist, können nicht alle Bakterien mit dieser Technik definitiv klassifiziert werden. Dies führt zu gramvariablen und gramunbestimmten Gruppen.

Geschichte

Benannt ist die Methode nach ihrem Erfinder, dem dänischen Wissenschaftler Hans Christian Gram (1853–1938), der die Technik 1884 bei Carl Friedländer in der Leichenhalle des Städtischen Krankenhauses in Berlin entwickelte um eine Bakterienart von einer anderen zu unterscheiden, sondern Bakterien in gefärbten Abschnitten des Lungengewebes besser sichtbar zu machen. Er veröffentlichte seine Methode im Jahr 1884 und schloß in seinem kurzen Bericht über die Beobachtung , dass der Typhus - Bazillus nicht den Fleck behalten hat.

Verwendet

Gramfärbung von Candida albicans aus einem Vaginalabstrich. Die kleinen ovalen Chlamydosporen haben einen Durchmesser von 2–4 µm .

Die Gramfärbung ist eine bakteriologische Labortechnik , mit der Bakterienarten anhand der physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände in zwei große Gruppen ( grampositiv und gramnegativ ) unterschieden werden können . Die Gram-Färbung wird nicht verwendet, um Archaeen , ehemals Archaebakterien, zu klassifizieren , da diese Mikroorganismen sehr unterschiedliche Antworten liefern, die nicht ihren phylogenetischen Gruppen folgen .

Einige Organismen sind gramvariabel (was bedeutet, dass sie sich entweder negativ oder positiv färben); einige sind mit keinem der in der Gram-Technik verwendeten Farbstoffe gefärbt und werden nicht gesehen. In einem modernen Labor für Umwelt- oder Molekularmikrobiologie erfolgt die Identifizierung meist mit genetischen Sequenzen und anderen molekularen Techniken, die weitaus spezifischer und informativer sind als die Differenzfärbung.

Medizinisch

Gram Flecke auf geführte Körperflüssigkeit oder Biopsie , wenn eine Infektion vermutet wird. Gram-Färbungen liefern viel schneller Ergebnisse als die Kultivierung und sind besonders wichtig, wenn eine Infektion einen wichtigen Unterschied in der Behandlung und Prognose des Patienten machen würde; Beispiele sind Liquor cerebrospinalis bei Meningitis und Synovialflüssigkeit bei septischer Arthritis .

Färbemechanismus

Violett gefärbtes Gram-positiv (links) und Rosa gefärbtes Gram-negativ (rechts)

Gram-positive Bakterien haben eine dicke netzartige Zellwand aus Peptidoglycan (50–90% der Zellhülle) und werden dadurch durch Kristallviolett violett gefärbt, während gram-negative Bakterien eine dünnere Schicht haben (10% der Zellhülle) Umschlag), behalten also nicht die violette Färbung und werden mit Safranin rosa gegengefärbt. Es gibt vier grundlegende Schritte der Gram-Färbung:

  • Auftragen einer Primärfärbung ( Kristallviolett ) auf einen hitzefixierten Ausstrich einer Bakterienkultur. Die Hitzefixierung tötet einige Bakterien ab, wird aber meistens verwendet, um die Bakterien auf dem Objektträger zu fixieren , damit sie während des Färbevorgangs nicht ausgespült werden.
  • Die Zugabe von Jod , das an Kristallviolett bindet und es in der Zelle einfängt
  • Schnelle Entfärbung mit Ethanol oder Aceton
  • Die Gegen mit Safranin . Carbolfuchsin wird manchmal für Safranin ersetzt, da es anaerobe Bakterien intensiver färbt, aber es wird weniger häufig als Gegenfärbung verwendet.
Zusammenfassung der Gram-Färbung
Anwendung von Reagens Zellenfarbe
Gram-positiv Gram-negativ
Primärfarbstoff Kristallviolett Violett Violett
Beize Jod Violett Violett
Entfärber Alkohol / Aceton Violett farblos
Gegen Fleck Safranin / Karbolfuchsin Violett rosa oder rot

Kristallviolett (CV) dissoziiert in wässrigen Lösungen in CV+
und Chlorid ( Cl
) Ionen. Diese Ionen durchdringen die Zellwand von grampositiven und gramnegativen Zellen. Der Lebenslauf+
Ion interagiert mit negativ geladenen Komponenten von Bakterienzellen und färbt die Zellen lila.

Jodid ( I
oder ich
3
) interagiert mit Lebenslauf+
und bildet große Komplexe aus Kristallviolett und Jod (CV-I) innerhalb der inneren und äußeren Schichten der Zelle. Jod wird oft als Beizmittel bezeichnet , ist jedoch ein Einfangmittel, das die Entfernung des CV-I-Komplexes verhindert und daher die Zelle färbt.

Wenn ein Entfärber wie Alkohol oder Aceton hinzugefügt wird, interagiert es mit den Lipiden der Zellmembran. Eine gramnegative Zelle verliert ihre äußere Lipopolysaccharidmembran und die innere Peptidoglycanschicht bleibt frei. Die CV-I-Komplexe werden zusammen mit der äußeren Membran aus der gramnegativen Zelle gewaschen. Im Gegensatz dazu wird eine grampositive Zelle durch eine Ethanolbehandlung dehydriert. Die großen CV-I-Komplexe werden aufgrund der vielschichtigen Natur ihres Peptidoglykans in der grampositiven Zelle eingeschlossen. Der Entfärbungsschritt ist kritisch und muss richtig zeitlich abgestimmt werden; die Kristallviolett-Färbung wird sowohl von grampositiven als auch von negativen Zellen entfernt, wenn das Entfärbungsmittel zu lange (eine Sache von Sekunden) belassen wird.

Nach der Entfärbung bleibt die grampositive Zelle violett und die gramnegative Zelle verliert ihre violette Farbe. Gegenfärbung, die normalerweise positiv geladenes Safranin oder basisches Fuchsin ist, wird zuletzt aufgetragen, um entfärbten gramnegativen Bakterien eine rosa oder rote Farbe zu verleihen. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien nehmen die Gegenfärbung auf. Die Gegenfärbung ist jedoch bei grampositiven Bakterien wegen der dunkleren Kristallviolettfärbung nicht sichtbar.

Beispiele

Gram-positive Bakterien

Gram-positive Bakterien haben im Allgemeinen eine einzelne Membran ( Monoderm ), die von einem dicken Peptidoglykan umgeben ist. Dieser Regel folgen zwei Stämme: Firmicutes (mit Ausnahme der Klassen Mollicutes und Negativicutes ) und die Actinobakterien . Im Gegensatz dazu sind Mitglieder der Chloroflexi (grüne Nicht-Schwefel-Bakterien) Monodermen, besitzen aber ein dünnes oder fehlendes (Klasse Dehalococcoidetes ) Peptidoglycan und können negativ, positiv oder unbestimmt färben; Mitglieder der Deinococcus-Thermus- Gruppe färben sich positiv, sind aber Diderme mit einem dicken Peptidoglykan.

Historisch gesehen bildeten die grampositiven Formen den Stamm Firmicutes , ein Name, der heute für die größte Gruppe verwendet wird. Es umfasst viele bekannte Gattungen wie Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus und Clostridium . Es wurde auch um die Mollicutes erweitert, Bakterien wie Mycoplasma und Thermoplasma , denen Zellwände fehlen und die daher nicht Gram-gefärbt werden können, sondern von solchen Formen stammen.

Einige Bakterien haben Zellwände, die Flecken besonders gut zurückhalten können. Diese erscheinen bei der Gram-Färbung positiv, obwohl sie nicht eng mit anderen grampositiven Bakterien verwandt sind. Diese werden als säurefeste Bakterien bezeichnet und können nur durch spezielle Färbeverfahren von anderen grampositiven Bakterien unterschieden werden .

Gram-negative Bakterien

Gram-negative Bakterien besitzen in der Regel eine dünne Peptidoglycanschicht zwischen zwei Membranen ( Diderm ). Lipopolysaccharid (LPS) ist das häufigste Antigen auf der Zelloberfläche der meisten gramnegativen Bakterien und trägt bis zu 80 % der äußeren Membran von E. coli und Salmonella bei . Die meisten Bakterienstämme sind gram-negativ, einschließlich der Cyanobakterien , der grünen Schwefelbakterien und der meisten Proteobakterien (Ausnahmen sind einige Mitglieder der Rickettsiales und die Insekten-Endosymbionten der Enterobacteriales ).

Gram-variable und Gram-unbestimmte Bakterien

Einige Bakterien ergeben nach der Färbung mit der Gram-Färbung ein gramvariables Muster: eine Mischung aus rosa und violetten Zellen ist zu sehen. In Kulturen von Bacillus, Butyrivibrio und Clostridium fällt eine Abnahme der Peptidoglycandicke während des Wachstums mit einer Zunahme der Anzahl von Zellen zusammen, die sich gramnegativ färben. Darüber hinaus kann bei allen Bakterien, die mit der Gram-Färbung gefärbt wurden, das Alter der Kultur die Ergebnisse der Färbung beeinflussen.

Gram-unbestimmte Bakterien reagieren nicht vorhersehbar auf Gram-Färbung und können daher weder als gram-positiv noch als gram-negativ bestimmt werden. Beispiele umfassen viele Arten von Mycobacterium , einschließlich Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae und Mycobacterium tuberculosis , von denen die beiden letzteren die Erreger von Lepra bzw. Tuberkulose sind. Bakterien der Gattung Mycoplasma haben keine Zellwand um ihre Zellmembranen , was bedeutet, dass sie sich nicht nach der Gram-Methode färben und gegen die Antibiotika resistent sind, die auf die Zellwandsynthese abzielen.

Orthographischer Hinweis

Der Begriff Gramfärbung leitet sich vom Nachnamen Hans Christian Gram ab ; der Namensgeber (Gram) wird daher großgeschrieben, aber nicht das Substantiv (Fleck), wie es für wissenschaftliche Begriffe üblich ist. Die Anfangsbuchstaben von gram-positiv und gram-negativ , die namensgebende Adjektive sind , können entweder ein großes G oder ein kleines g sein , je nachdem, welcher Stilleitfaden (falls vorhanden) das zu schreibende Dokument regelt. Der Kleinbuchstabenstil wird von den US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten und anderen Stilrichtungen wie dem AMA-Stil verwendet . Wörterbücher können Kleinbuchstaben, Großbuchstaben oder beides verwenden. Versalien Gram-positive oder Gram-negative Nutzung ist in vielen auch gemeinsame wissenschaftlichen Zeitschrift Artikeln und Veröffentlichungen. Wenn Artikel bei Zeitschriften eingereicht werden, kann jede Zeitschrift den Hausstil auf die Postprint- Version anwenden oder nicht . Preprint- Versionen enthalten den Stil, den der Autor zufällig verwendet hat. Selbst Stilschemata, die Kleinbuchstaben für die Adjektive gram-positiv und gram-negativ verwenden, verwenden normalerweise immer noch Großbuchstaben für Gram-Färbung .

Siehe auch

Verweise

Externe Links