Isotherme Titrationskalorimetrie - Isothermal titration calorimetry

Isotherme Titrationskalorimetrie

Akronym	ITC
Einstufung	Thermische Analyse
Hersteller	TA Instruments , Microcal/Malvern Instrumente
Andere Techniken
Verwandt	Isotherme Mikrokalorimetrie Dynamische Differenzkalorimetrie

Die isotherme Titrationskalorimetrie ( ITC ) ist eine physikalische Technik zur Bestimmung der thermodynamischen Parameter von Wechselwirkungen in Lösung. Es wird am häufigsten verwendet, um die Bindung kleiner Moleküle (wie medizinische Verbindungen) an größere Makromoleküle ( Proteine , DNA usw.) zu untersuchen. Es besteht aus zwei Zellen, die von einem adiabatischen Mantel umgeben sind. Die zu untersuchenden Verbindungen werden in die Probenküvette gegeben, während die andere Küvette, die Referenzküvette, als Kontrolle dient und den Puffer enthält, in dem die Probe gelöst ist.

Thermodynamische Messungen

ITC ist eine quantitative Technik, die bestimmen kann , die Bindungsaffinität ( ) Enthalpie Änderungen ( ) und Bindungs Stöchiometrie ( ) der Interaktion zwischen zwei oder mehreren Molekülen in Lösung. Aus diesen anfänglichen Messungen können die Änderungen der freien Gibbs-Energie ( ) und die Entropieänderungen ( ) unter Verwendung der Beziehung bestimmt werden: ${\displaystyle K_{a}}$${\displaystyle \Delta H}$${\displaystyle n}$${\displaystyle \Delta G}$${\displaystyle \Delta S}$

${\displaystyle \Updelta G=-RT\ln {K_{a}}=\Updelta HT\Updelta S}$

(wo ist die Gaskonstante und die absolute Temperatur ). ${\displaystyle R}$${\displaystyle T}$

Für genaue Messungen der Bindungsaffinität muss die Kurve des Thermogramms sigmoidal sein. Der Verlauf der Kurve wird durch den c-Wert bestimmt, der nach folgender Gleichung berechnet wird:

${\displaystyle c=nK_{a}M}$

wobei die Stöchiometrie der Bindung, die Assoziationskonstante und die Konzentration des Moleküls in der Zelle ist. ${\displaystyle n}$${\displaystyle K_{a}}$${\displaystyle M}$

Das Instrument

Ein isothermes Titrationskalorimeter besteht aus zwei identischen Zellen aus einem hocheffizienten wärmeleitenden und chemisch inerten Material wie Hastelloy- Legierung oder Gold, die von einem adiabatischen Mantel umgeben sind. Empfindliche Thermosäulen/Thermoelement-Schaltungen werden verwendet, um Temperaturunterschiede zwischen der Referenzzelle (gefüllt mit Puffer oder Wasser) und der Probenzelle mit dem Makromolekül zu erkennen. Vor der Zugabe des Liganden wird eine konstante Leistung (<1 mW) an die Referenzzelle angelegt. Dies leitet eine Rückkopplungsschaltung, die eine Heizung aktiviert, die sich an der Probenzelle befindet. Während des Experiments wird Ligand in genau bekannten Aliquots in die Probenküvette titriert, wodurch Wärme aufgenommen oder entwickelt wird (je nach Art der Reaktion). Die Messungen bestehen aus der zeitabhängigen Leistungsaufnahme, die erforderlich ist, um gleiche Temperaturen zwischen Proben- und Referenzzelle aufrechtzuerhalten.

Bei einer exothermen Reaktion erhöht sich die Temperatur in der Probenküvette bei Zugabe des Liganden . Dies bewirkt, dass die Rückkopplungsleistung an die Probenzelle verringert wird (denken Sie daran: eine Referenzleistung wird an die Referenzzelle angelegt), um eine gleiche Temperatur zwischen den beiden Zellen aufrechtzuerhalten. Bei einer endothermen Reaktion tritt das Gegenteil ein; der Rückführkreis erhöht die Leistung, um eine konstante Temperatur zu halten (isothermer/isothermer Betrieb).

Die Beobachtungen werden als Leistung aufgetragen, die benötigt wird, um die Referenz- und die Probenzelle auf einer identischen Temperatur gegen die Zeit zu halten. Als Ergebnis bestehen die experimentellen Rohdaten aus einer Reihe von Spitzen des Wärmeflusses (Leistung), wobei jede Spitze einer Ligandeninjektion entspricht. Diese Spitzen/Impulse des Wärmeflusses werden in Bezug auf die Zeit integriert, was die gesamte pro Injektion ausgetauschte Wärme ergibt. Das Muster dieser Wärmeeffekte als Funktion des Molverhältnisses [Ligand]/[Makromolekül] kann dann analysiert werden, um die thermodynamischen Parameter der untersuchten Wechselwirkung zu erhalten. Das Entgasen von Proben ist häufig erforderlich, um gute Messungen zu erhalten, da das Vorhandensein von Gasblasen in der Probenzelle zu anormalen Datenaufzeichnungen in den aufgezeichneten Ergebnissen führt. Der gesamte Versuch findet computergesteuert statt.

Anwendung in der Wirkstoffforschung

ITC ist eine der neuesten Techniken zur Charakterisierung der Bindungsaffinität von Liganden für Proteine. Es wird typischerweise als sekundäre Screening-Technik beim High-Throughput-Screening verwendet. ITC ist besonders nützlich, da es nicht nur die Bindungsaffinität, sondern auch die Thermodynamik der Bindung angibt. Diese thermodynamische Charakterisierung ermöglicht eine weitere Optimierung von Verbindungen.

Siehe auch

• Differenzkalorimetrie
• Dual-Polarisations-Interferometrie
• Druckstörungskalorimetrie
• Oberflächenplasmonenresonanz

Verweise