Ligation (Molekularbiologie) - Ligation (molecular biology)

Dieser Artikel ist über die Ligation von Nukleinsäuren. Für die Ligation von Peptiden siehe Chemische Ligation . Für andere Verwendungen siehe Ligation (Begriffsklärung) .
Eine klebrige Endligatur

In der Molekularbiologie , die Ligation ist die Verbindung von zwei Nukleinsäurefragmenten durch die Wirkung eines Enzyms. Es ist ein wesentliches Laborverfahren beim molekularen Klonen von DNA, bei dem DNA-Fragmente zu rekombinanten DNA- Molekülen verbunden werden, beispielsweise wenn ein fremdes DNA-Fragment in ein Plasmid eingefügt wird . Die Enden von DNA-Fragmenten werden durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3'-Hydroxyl eines DNA-Terminus mit dem 5'-Phosphoryl eines anderen verbunden. RNA kann auch auf ähnliche Weise ligiert werden. An der Reaktion ist im Allgemeinen ein Cofaktor beteiligt, und dies ist normalerweise ATP oder NAD + .

Die Ligation im Labor wird normalerweise unter Verwendung von T4- DNA-Ligase durchgeführt , jedoch sind auch Verfahren zur Ligation ohne die Verwendung von Standard-DNA-Ligase beliebt.

Ligationsreaktion

Der Mechanismus der Ligationsreaktion wurde erstmals im Labor von I. Robert Lehman aufgeklärt. Zwei DNA-Fragmente können durch DNA-Ligase miteinander verbunden werden , die die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-OH an einem Ende eines DNA-Strangs und der 5'-Phosphatgruppe eines anderen katalysiert. Bei Tieren und Bakteriophagen wird ATP als Energiequelle für die Ligation verwendet, während bei Bakterien NAD + verwendet wird.

Die DNA-Ligase reagiert zuerst mit ATP oder NAD + und bildet ein Ligase-AMP-Zwischenprodukt, wobei das AMP über eine Phosphoamid-Bindung an die ε-Aminogruppe von Lysin im aktiven Zentrum der Ligase gebunden ist. Diese Adenylylgruppe wird dann auf die Phosphatgruppe am 5'-Ende einer DNA-Kette übertragen, wodurch ein DNA-Adenylat-Komplex gebildet wird. Schließlich wird über den nukleophilen Angriff des 3'-Hydroxyls am Ende eines DNA-Strangs an der aktivierten 5'-Phosphorylgruppe eines anderen eine Phosphodiesterbindung zwischen den beiden DNA-Enden gebildet.

Ein Nick in der DNA (dh ein Bruch in einem Strang einer doppelsträngigen DNA) kann durch die Ligase sehr effizient repariert werden. Ein komplizierendes Merkmal der Ligation tritt jedoch auf, wenn zwei separate DNA-Enden ligiert werden, da die beiden Enden zusammenkommen müssen, bevor die Ligationsreaktion ablaufen kann. Bei der Ligation von DNA mit klebrigen oder kohäsiven Enden können die hervorstehenden DNA-Stränge bereits miteinander verbunden sein, daher ist dies ein relativ effizienter Prozess, da er der Reparatur von zwei Nicks in der DNA entspricht. Bei der Ligation von stumpfen Enden , die keine hervorstehenden Enden zum Annealing der DNA aufweisen, hängt der Prozess jedoch von einer zufälligen Kollision ab, damit sich die Enden aneinander ausrichten, bevor sie ligiert werden können, und ist folglich ein viel weniger effizienter Prozess. Die DNA-Ligase aus E. coli kann stumpfe DNA außer unter Bedingungen des molekularen Engstands nicht ligieren und wird daher normalerweise nicht für die Ligation im Labor verwendet. Stattdessen wird die DNA-Ligase des Phagen T4 verwendet, da sie sowohl stumpfe DNA als auch einzelsträngige DNA ligieren kann.

Faktoren, die die Ligatur beeinflussen

Faktoren, die eine enzymvermittelte chemische Reaktion beeinflussen, würden natürlich eine Ligationsreaktion beeinflussen, wie die Konzentration des Enzyms und der Reaktanten sowie die Reaktionstemperatur und die Inkubationszeit. Die Ligation wird dadurch erschwert, dass die gewünschten Ligationsprodukte für die meisten Ligationsreaktionen zwischen zwei verschiedenen DNA-Molekülen vorliegen sollten und die Reaktion sowohl inter- als auch intramolekulare Reaktionen beinhaltet und dass für eine effiziente Ligation ein zusätzlicher Annealing-Schritt notwendig ist.

Die drei Schritte zur Bildung einer neuen Phosphodiesterbindung während der Ligation sind: Enzymadenylierung, Adenylyltransfer auf DNA und Nick-Sealing. Mg(2+) ist ein Cofaktor für die Katalyse, daher ist die Ligationseffizienz bei hohen Konzentrationen von Mg(2+) hoch. Wenn die Konzentration von Mg(2+) begrenzt ist, ist das Nick-Sealing die geschwindigkeitsbestimmende Reaktion des Prozesses, und das adenylierte DNA-Zwischenprodukt verbleibt in der Lösung. Eine solche Adenylierung des Enzyms hemmt die erneute Bindung an den adenylierten DNA-Zwischenvergleich einer Achillesferse von LIG1 und stellt ein Risiko dar, wenn sie nicht fixiert werden.

DNA-Konzentration

Die Konzentration der DNA kann die Ligationsgeschwindigkeit beeinflussen und ob die Ligation eine intermolekulare oder intramolekulare Reaktion ist. Bei der Ligation werden die Enden einer DNA mit anderen Enden verbunden, jedoch hat jedes DNA-Fragment zwei Enden, und wenn die Enden kompatibel sind, kann ein DNA-Molekül durch Verbinden seiner eigenen Enden zirkularisieren. Bei hoher DNA-Konzentration besteht eine größere Chance, dass ein Ende eines DNA-Moleküls auf das Ende einer anderen DNA trifft, wodurch eine intermolekulare Ligation entsteht. Bei einer niedrigeren DNA-Konzentration steigt die Wahrscheinlichkeit, dass ein Ende eines DNA-Moleküls auf das andere Ende desselben Moleküls trifft, daher ist eine intramolekulare Reaktion , die die DNA zirkularisiert, wahrscheinlicher. Die Transformationseffizienz von linearer DNA ist auch viel geringer als die von zirkulärer DNA, und damit die DNA zirkularisieren kann, sollte die DNA-Konzentration nicht zu hoch sein. Als allgemeine Regel sollte die Gesamt-DNA-Konzentration weniger als 10 µg/ml betragen.

Die relative Konzentration der DNA-Fragmente, ihre Länge sowie Pufferbedingungen sind ebenfalls Faktoren, die beeinflussen können, ob intermolekulare oder intramolekulare Reaktionen begünstigt werden.

Die DNA-Konzentration kann künstlich erhöht werden durch Zugabe von Kondensationsmitteln wie Kobalthexamin und biogenen Polyaminen wie Spermidin oder durch die Verwendung von Verdrängungsmitteln wie Polyethylenglykol (PEG), die ebenfalls die effektive Konzentration von Enzymen erhöhen. Beachten Sie jedoch, dass Zusatzstoffe wie Kobalthexamin ausschließlich intermolekulare Reaktionen hervorrufen können, was eher zu linearen Konkatemeren als zu zirkulärer DNA führt, die für die Transformation von Plasmid-DNA besser geeignet sind und daher für die Plasmidligation unerwünscht sind. Wenn es notwendig ist, Additive bei der Plasmidligation zu verwenden, ist die Verwendung von PEG vorzuziehen, da es sowohl die intramolekulare als auch die intermolekulare Ligation fördern kann.

Ligasekonzentration

Je höher die Ligasekonzentration, desto schneller die Ligationsrate. Blunt-End-Ligation ist viel weniger effizient als die Sticky-End-Ligation, daher wird bei der Blunt-End-Ligation eine höhere Ligasekonzentration verwendet. Eine hohe DNA-Ligase-Konzentration kann in Verbindung mit PEG für eine schnellere Ligation verwendet werden, und sie sind die Komponenten, die häufig in kommerziellen Kits für eine schnelle Ligation zu finden sind.

Temperatur

Bei der Betrachtung der Temperatur einer Ligationsreaktion spielen zwei Aspekte eine Rolle. Erstens die optimale Temperatur für die DNA-Ligase-Aktivität, die 37 ° C beträgt , und zweitens die Schmelztemperatur (T m ) der zu ligierenden DNA-Enden. Die Schmelztemperatur hängt von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Überhangs ab – je größer die Anzahl von G und C, desto höher ist die T m, da zwischen dem GC-Basenpaar drei Wasserstoffbrücken gebildet werden, verglichen mit zwei für das AT-Basenpaar – mit einigen Beitrag aus der Stapelung der Basen zwischen den Fragmenten. Damit die Ligationsreaktion effizient abläuft, sollten die Enden stabil angelagert sein, und in Ligationsexperimenten ist die T m der DNA-Enden im Allgemeinen viel niedriger als 37 ° C. Die optimale Temperatur zum Ligieren kohäsiver Enden ist daher ein Kompromiss zwischen den besten Temperatur für die DNA - Ligase - Aktivität und die T m , wo die Enden zuordnen können. Unterschiedliche Restriktionsenzyme erzeugen jedoch unterschiedliche Enden, und die Basenzusammensetzung der von diesen Enzymen produzierten Enden kann sich auch unterscheiden, die Schmelztemperatur und damit die optimale Temperatur kann je nach den verwendeten Restriktionsenzymen stark variieren, und die optimale Temperatur für die Ligation kann zwischen 4-15 ° C je nach den Enden. Ligationen beinhalten auch oft Ligationsenden, die von verschiedenen Restriktionsenzymen in derselben Reaktionsmischung erzeugt werden, daher kann es nicht praktikabel sein, die optimale Temperatur für eine bestimmte Ligationsreaktion auszuwählen, und die meisten Protokolle wählen einfach 12-16 ° C, Raumtemperatur oder 4 ° C .

Pufferzusammensetzung

Die Ionenstärke des verwendeten Puffers kann die Ligation beeinflussen. Die Art der Anwesenheit von Kationen kann auch die Ligationsreaktion beeinflussen, zum Beispiel kann eine überschüssige Menge an Na + dazu führen, dass die DNA steifer wird und die Wahrscheinlichkeit einer intermolekularen Ligation erhöht wird. Bei hohen Konzentrationen an monovalenten Kationen (>200 mM) kann die Ligation auch fast vollständig gehemmt werden. Der für die Ligation verwendete Standardpuffer wurde entwickelt, um ionische Effekte zu minimieren.

Sticky-End-Ligation

Restriktionsenzyme können eine Vielzahl von Enden in der von ihnen verdauten DNA erzeugen, aber in Klonierungsexperimenten erzeugen die am häufigsten verwendeten Restriktionsenzyme einen 4-Basen-Einzelstrangüberhang, der als klebriges oder kohäsives Ende bezeichnet wird (Ausnahmen umfassen Nde I, das ein 2- Basisüberhang und solche, die stumpfe Enden erzeugen). Diese klebrigen Enden können an andere kompatible Enden anlagern und in einer klebrigen (oder kohäsiven) Ligation ligiert werden. Eco RI erzeugt zum Beispiel ein AATT-Ende, und da A und T eine niedrigere Schmelztemperatur als C und G haben, ist seine Schmelztemperatur T m mit etwa 6 ° C niedrig . Für die meisten Restriktionsenzyme haben die erzeugten Überhänge eine T m , die ist ca. 15 ° C. Für praktische Zwecke werden klebrige Endligationen bei 12-16 ° C oder bei Raumtemperatur oder alternativ bei 4 ° C über einen längeren Zeitraum durchgeführt.

Für die Insertion eines DNA-Fragments in einen Plasmidvektor werden vorzugsweise zwei verschiedene Restriktionsenzyme verwendet, um die DNA zu verdauen, so dass unterschiedliche Enden erzeugt werden. Die beiden unterschiedlichen Enden können die Religation des Vektors ohne jegliches Insert verhindern und ermöglichen auch eine gerichtete Insertion des Fragments.

Wenn es nicht möglich ist, zwei verschiedene Stellen zu verwenden, muss die Vektor-DNA möglicherweise dephosphoryliert werden, um einen hohen Hintergrund von rezirkularisierter Vektor-DNA ohne Insert zu vermeiden. Ohne eine Phosphatgruppe an den Enden kann der Vektor nicht mit sich selbst ligieren, kann aber an ein Insert mit einer Phosphatgruppe ligiert werden. Die Dephosphorylierung erfolgt üblicherweise unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIAP), die die Phosphatgruppe vom 5'-Ende der verdauten DNA entfernt. Beachten Sie jedoch, dass CIAP nicht leicht zu inaktivieren ist und die Ligation ohne einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung des CIAP stören kann. was zum Versagen der Ligatur führt. CIAP sollte nicht in übermäßigen Mengen und nur bei Bedarf verwendet werden. Als Alternative eignen sich Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) oder Antarktische Phosphatase (AP), da sie leicht inaktiviert werden können.

Stumpfe Ligatur

Die Ligation des stumpfen Endes beinhaltet keine Basenpaarung der hervorstehenden Enden, so dass jedes stumpfe Ende an ein anderes stumpfes Ende ligiert werden kann. Stumpfe Enden können durch Restriktionsenzyme wie Sma I und Eco RV erzeugt werden . Ein großer Vorteil der Klonierung mit glatten Enden besteht darin, dass das gewünschte Insert keine Restriktionsschnittstellen in seiner Sequenz benötigt, da glatte Enden normalerweise in einer PCR erzeugt werden , und das durch PCR erzeugte DNA-Fragment mit glatten Enden kann dann in ein glattes DNA-Fragment ligiert werden. beendeten Vektor, der aus Restriktionsverdau erzeugt wurde.

Die Ligation mit stumpfen Enden ist jedoch viel weniger effizient als die Ligation mit klebrigen Enden, typischerweise ist die Reaktion 100-mal langsamer als die Ligation mit klebrigen Enden. Da das stumpfe Ende keine hervorstehenden Enden hat, hängt die Ligationsreaktion von zufälligen Kollisionen zwischen den stumpfen Enden ab und ist folglich viel weniger effizient. Um die geringere Effizienz zu kompensieren, ist die verwendete Ligasekonzentration höher als bei der klebrigen Endligation (10x oder mehr). Die DNA-Konzentration, die bei der Ligation mit stumpfen Enden verwendet wird, ist ebenfalls höher, um die Wahrscheinlichkeit von Kollisionen zwischen den Enden zu erhöhen, und eine längere Inkubationszeit kann auch für Ligationen mit stumpfen Enden verwendet werden.

Wenn beide Enden, die in einen Vektor ligiert werden müssen, stumpfe Enden haben, muss der Vektor dephosphoryliert werden, um die Selbstligation zu minimieren. Dies kann unter Verwendung von CIAP erfolgen, aber wie bereits erwähnt, ist bei der Verwendung Vorsicht geboten. Da der Vektor dephosphoryliert wurde und die Ligation die Anwesenheit eines 5'-Phosphats erfordert, muss das Insert phosphoryliert werden. Dem stumpfendigen PCR-Produkt fehlt normalerweise ein 5'-Phosphat, daher muss es durch Behandlung mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert werden .

Die stumpfe Ligation wird auch durch eine hohe ATP-Konzentration reversibel gehemmt.

PCR erzeugt normalerweise PCR-Produkte mit glatten Enden, aber beachten Sie, dass die PCR mit Taq- Polymerase ein zusätzliches Adenin (A) an das 3'-Ende des PCR-Produkts hinzufügen kann. Diese Eigenschaft kann bei der TA-Klonierung ausgenutzt werden, bei der die Enden des PCR-Produkts an das T-Ende eines Vektors anlagern können. Die TA-Ligation ist daher eine Form der klebrigen Endligation. Vektoren mit stumpfen Enden können in Vektoren für die TA-Ligation mit Didesoxythymidintriphosphat (ddTTP) unter Verwendung von terminaler Transferase umgewandelt werden.

Generelle Richtlinien

Zur Klonierung eines Inserts in ein zirkuläres Plasmid:

  • Die verwendete Gesamt-DNA-Konzentration sollte weniger als 10 µg/ml betragen, da das Plasmid rezirkularisieren muss.
  • Das Molverhältnis von Insert zu Vektor wird normalerweise bei etwa 3:1 verwendet. Ein sehr hohes Verhältnis kann mehrere Einsätze erzeugen. Das Verhältnis kann je nach Größe des Einsatzes angepasst werden, und es können auch andere Verhältnisse verwendet werden, beispielsweise 1:1.

Fehlerbehebung

Manchmal führt die Ligation nicht zu den gewünschten ligierten Produkten, und einige der möglichen Gründe können sein:

  • Beschädigte DNA – Eine übermäßige UV-Strahlung während der Vorbereitung der DNA für die Ligation kann die DNA schädigen und die Transformationseffizienz erheblich reduzieren . Eine höherwellige UV-Strahlung (365 nm), die die DNA weniger schädigt, sollte verwendet werden, wenn über einen längeren Zeitraum an der DNA auf einem UV-Transilluminator gearbeitet werden muss. Die Zugabe von Cytidin oder Guanosin zum Elektrophoresepuffer bei einer Konzentration von 1 mM kann jedoch die DNA vor Beschädigung schützen.
  • Falsche Verwendung von CIAP oder seine ineffiziente Inaktivierung oder Entfernung.
  • Zu viel DNA verwendet.
  • Unvollständiger DNA-Verdau – Die unvollständig verdaute Vektor-DNA führt zu einem hohen Hintergrund, der durch eine Ligation ohne Insert als Kontrolle überprüft werden kann. Insert, das nicht vollständig verdaut ist, wird auch nicht richtig ligiert und zirkularisiert. Stellen Sie beim Verdauen eines PCR-Produkts sicher, dass den 5'-Enden der für die PCR verwendeten Oligonukleotide genügend zusätzliche Basen hinzugefügt wurden, da viele Restriktionsenzyme für einen effizienten Verdau eine minimale Anzahl zusätzlicher Basenpaare benötigen. Die Informationen über das erforderliche Minimum an Basenpaar sind von Restriktionsenzym-Lieferanten wie im Katalog von New England Biolabs erhältlich .
  • Unvollständige Ligation – DNA mit stumpfen Enden (zB Sma I ) und einige DNA mit klebrigen Enden (zB Nde I ), die eine niedrige Schmelztemperatur haben, erfordern mehr Ligase und eine längere Inkubationszeit.
  • Protein, das von einem ligierten Gen-Insert exprimiert wird, ist für Zellen toxisch.
  • Homologe Sequenz von Insert zu Sequenz in Plasmid-DNA, was zur Deletion führt.

Andere Methoden der DNA-Ligation

Eine Reihe von kommerziell erhältlichen DNA-Klonierungskits verwenden andere Ligierungsverfahren, die die Verwendung der üblichen DNA-Ligasen nicht erfordern. Diese Verfahren ermöglichen eine viel schnellere Klonierung sowie eine einfachere Übertragung des klonierten DNA-Inserts auf verschiedene Vektoren . Diese Verfahren erfordern jedoch die Verwendung speziell entworfener Vektoren und Komponenten und können an Flexibilität mangeln.

Topoisomerase-vermittelte Ligation

Anstelle von Ligase kann zur Ligation Topoisomerase verwendet werden, und die Klonierung kann schneller durchgeführt werden, ohne dass ein Restriktionsverdau des Vektors oder Inserts erforderlich ist. Bei diesem TOPO-Klonierungsverfahren wird ein linearisierter Vektor aktiviert, indem Topoisomerase I an seinen Enden befestigt wird, und dieser "TOPO-aktivierte" Vektor kann dann ein PCR-Produkt annehmen, indem er an beide 5'-Enden des PCR-Produkts ligiert, die Topoisomerase wird freigesetzt und ein kreisförmiger Vektor wird dabei gebildet.

Homologe Rekombination

Ein weiteres Klonierungsverfahren ohne die Verwendung von Ligase ist die DNA - Rekombination , wie sie beispielsweise im Gateway - Klonierungssystem verwendet wird . Das einmal in den Klonierungsvektor klonierte Gen (in diesem Verfahren als Eintrittsklon bezeichnet) kann bequem durch Rekombination in eine Vielzahl von Expressionsvektoren eingeführt werden.

Siehe auch

Verweise