Luziferase - Luciferase

Bakterielle Luciferase-Monooxygenase-Familie
Identifikatoren
Symbol Bac_luciferase
Pfam PF00296
InterPro IPR016048
PROSITE PDOC00397
SCOP2 1nfp / Scope / SUPFAM
Katalytische Domäne der Dinoflagellat-Luciferase
PDB 1vpr EBI.jpg
Kristallstruktur einer Luciferase-Domäne aus dem Dinoflagellaten Lingulodinium polyedrum
Identifikatoren
Symbol Luciferase_cat
Pfam PF10285
InterPro IPR018804
Dinoflagellaten Luciferase/LBP N-terminale Domäne
Identifikatoren
Symbol Luciferase_N
Pfam PF05295
InterPro IPR007959
Dinoflagellat Luciferase helikale Bündeldomäne
Identifikatoren
Symbol Luciferase_3H
Pfam PF10284
InterPro IPR018475

Luciferase ist ein Oberbegriff für die Klasse oxidativer Enzyme , die Biolumineszenz erzeugen und wird normalerweise von einem Photoprotein unterschieden . Der Name wurde zuerst von Raphaël Dubois verwendet , der die Wörter Luciferin und Luciferase für das und Enzym erfand . Beide Wörter leiten sich vom lateinischen Wort lucifer ab , was „Lichtträger“ bedeutet, das wiederum von den lateinischen Wörtern für „Licht“ ( lux) und „bringen oder tragen“ ( ferre) abgeleitet ist .

Glühwürmchen-Luciferase
Firefly Luciferase Crystal Structure.rsh.png
Struktur der Luciferase des Photinus pyralis Glühwürmchens .
Identifikatoren
Organismus Photinus pyralis
Symbol Glühwürmchen-Luciferase
PDB 1LCI Mehr Strukturen
UniProt P08659
Andere Daten
EG-Nummer 1.13.12.7

Luciferasen werden häufig in der Biotechnologie , für die Mikroskopie und als Reportergene für viele der gleichen Anwendungen wie fluoreszierende Proteine ​​verwendet . Im Gegensatz zu fluoreszierenden Proteinen benötigen Luciferasen jedoch keine externe Lichtquelle , sondern die Zugabe von Luciferin , dem konsumierbaren Substrat.

Beispiele

Eine Vielzahl von Organismen regulieren ihre Lichtproduktion mithilfe verschiedener Luciferasen in einer Vielzahl von Licht emittierenden Reaktionen. Die Mehrheit der untersuchten Luciferasen wurde bei Tieren gefunden, einschließlich Glühwürmchen und vielen Meerestieren wie Copepoden , Quallen und dem Seestiefmütterchen . Luciferasen wurden jedoch in leuchtenden Pilzen wie dem Jack-O-Lantern-Pilz sowie an Beispielen in anderen Königreichen einschließlich leuchtender Bakterien und Dinoflagellaten untersucht .

Glühwürmchen und Klickkäfer

Die Luciferasen der Glühwürmchen – von denen es über 2000 Arten gibt – und der anderen Elateroidea (Schnellkäfer und Verwandte im Allgemeinen) sind vielfältig genug, um in der molekularen Phylogenie nützlich zu sein . Bei Glühwürmchen wird der benötigte Sauerstoff durch einen Schlauch im Bauchraum, die sogenannte abdominale Trachea, zugeführt . Eine gut untersuchte Luciferase ist die des Photinini- Glühwürmchens Photinus pyralis mit einem optimalen pH-Wert von 7,8.

Seestiefmütterchen

Auch gut untersucht ist die Seestiefmütterchen , Renillareniformis . In diesem Organismus ist die Luciferase ( Renilla-Luciferin-2-Monooxygenase ) eng mit einem Luciferin-bindenden Protein sowie einem grün fluoreszierenden Protein ( GFP ) verbunden. Calcium löst die Freisetzung des Luciferins ( Coelenterazin ) aus dem Luciferin-bindenden Protein aus. Das Substrat steht dann für die Oxidation durch die Luciferase zur Verfügung, wo es unter Freisetzung von Energie zu Coelenteramid abgebaut wird. Ohne GFP würde diese Energie als Photon aus blauem Licht (Peak-Emissionswellenlänge 482 nm) freigesetzt. Aufgrund des eng assoziierten GFP wird die von der Luciferase freigesetzte Energie jedoch stattdessen durch Resonanzenergietransfer an das Fluorophor des GFP gekoppelt und anschließend als Photon von grünem Licht (Spitzenemissionswellenlänge 510 nm) freigesetzt. Die katalysierte Reaktion ist:

Copepod

Neuere Luciferasen wurden kürzlich identifiziert, die im Gegensatz zu anderen Luciferasen natürlich sekretierte Moleküle sind. Ein solches Beispiel ist die Metridia Coelenterazin -abhängigen Luciferase (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) , die aus dem Meeres abgeleitet Copepod Metridia longa . Das von Metridia longa sekretierte Luciferase-Gen kodiert für ein 24 kDa-Protein, das ein N-terminales sekretorisches Signalpeptid mit 17 Aminosäureresten enthält . Die Sensitivität und hohe Signalintensität dieses Luciferase-Moleküls erweist sich in vielen Reporterstudien als vorteilhaft. Einige der Vorteile der Verwendung eines sekretierten Reportermoleküls wie MetLuc ist sein Protokoll ohne Lyse, das es ermöglicht, Lebendzell-Assays und mehrere Assays an derselben Zelle durchzuführen.

Bakterien

Bakterielle Biolumineszenz wird in den Photobacterium-Spezies Vibrio fischeri , Vibrio haweyi und Vibrio harveyi beobachtet . Die Lichtemission in einigen biolumineszenten Bakterien verwendet eine „Antenne“ wie das Lumazin- Protein, um die Energie aus dem primären angeregten Zustand der Luciferase aufzunehmen, was zu einem angeregten Lulnazin- Chromophor führt , der Licht mit einer kürzeren Wellenlänge (mehr Blau) emittiert, während in anderen verwenden ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) mit FMN als Chromophor und emittieren Licht, das im Vergleich zu Luciferase rotverschoben ist.

Dinoflagellaten

Dinoflagellaten - Luciferase ist ein Multi - Domain Eukaryot Protein, bestehend aus einer N-terminalen Domäne, und drei katalytische Domänen , von denen jede durch ein helikales Bündel Domäne vorausging. Die Struktur der katalytischen Domäne der Dinoflagellaten-Luciferase wurde aufgeklärt. Der Kernteil der Domäne ist ein 10 verseilt beta barrel das ist strukturell ähnlich zu Lipocaline und FABP . Die N-terminale Domäne ist zwischen Dinoflagellaten-Luciferase und Luciferin- Bindungsproteinen (LBPs) konserviert . Es wurde vorgeschlagen, dass diese Region eine Wechselwirkung zwischen LBP und Luciferase oder deren Assoziation mit der Vakuolenmembran vermitteln kann. Die spiralförmige Bündel Domain hat eine drei Helixbündel - Struktur , die vier wichtigen hält Histidine , die eine Rolle in der gedacht werden , um zu spielen pH Regulation des Enzyms . Im β-Fass der Dinoflagellaten-Luciferase bei pH 8 befindet sich eine große Tasche, um das Tetrapyrrol- Substrat aufzunehmen, aber es gibt keine Öffnung, um das Substrat eintreten zu lassen. Daher muss eine signifikante Konformationsänderung erfolgen, um Zugang und Raum für einen Liganden im aktiven Zentrum zu schaffen, und die Quelle für diese Änderung sind die vier N-terminalen Histidinreste. Bei pH 8 ist zu erkennen, dass die nicht protonierten Histidinreste an einem Netzwerk von Wasserstoffbrücken an der Grenzfläche der Helices im Bündel beteiligt sind, das den Substratzugang zum aktiven Zentrum und die Unterbrechung dieser Wechselwirkung durch Protonierung blockiert (bei pH 6,3) oder durch den Ersatz der Histidinreste durch Alanin verursacht eine große Molekülbewegung des Bündels, wodurch die Helices um 11Å getrennt werden und das katalytische Zentrum geöffnet wird. Logischerweise können die Histidinreste in der Natur nicht durch Alanin ersetzt werden, aber dieser experimentelle Austausch bestätigt weiter, dass die größeren Histidinreste das aktive Zentrum blockieren. Darüber hinaus könnten drei Gly-Gly-Sequenzen, eine in der N-terminalen Helix und zwei im Helix-Loop-Helix-Motiv, als Scharniere dienen, um die sich die Ketten drehen, um den Weg zum katalytischen Zentrum weiter zu öffnen und die aktive Seite? ˅.

Eine Dinoflagellaten-Luciferase ist aufgrund ihrer Wechselwirkung mit ihrem Substrat ( Luciferin ) und dem Luciferin-bindenden Protein (LBP) in der Scintillon- Organelle in Dinoflagellaten in der Lage, Licht zu emittieren . Die Luciferase wirkt in Übereinstimmung mit Luciferin und LBP, um Licht zu emittieren, aber jede Komponente funktioniert bei einem anderen pH-Wert. Luciferase und ihre Domänen sind bei pH 8 nicht aktiv, aber sie sind bei einem optimalen pH von 6,3 extrem aktiv, während LBP Luciferin bei pH 8 bindet und bei pH 6,3 freisetzt. Folglich wird Luciferin nur freigesetzt, um mit einer aktiven Luciferase zu reagieren, wenn das Scintillon auf pH 6,3 angesäuert wird. Daher wird , um den pH - Wert zu senken , spannungsabhängigen Kanäle in der Scintillon Membran geöffnet , um den Eintritt von ermöglichen Protonen von einer Vakuole einer besitzAktionsPotential aus einer mechanischen Stimulation erzeugt. Daraus ist ersichtlich, dass das Aktionspotential in der Vakuolenmembran zu einer Ansäuerung führt und dies wiederum ermöglicht, dass das Luciferin freigesetzt wird, um mit der Luciferase im Scintillon zu reagieren und einen blauen Lichtblitz zu erzeugen.

Reaktionsmechanismus

Alle Luciferasen werden als Oxidoreduktasen ( EC 1.13.12.- ) klassifiziert , d. h. sie wirken auf Einzelspender unter Einbau von molekularem Sauerstoff. Da Luciferasen aus vielen verschiedenen Proteinfamilien stammen , die nicht miteinander verwandt sind, gibt es keinen vereinheitlichenden Mechanismus, da jeder Mechanismus von der Luciferase- und Luciferin-Kombination abhängt. Es hat sich jedoch gezeigt, dass alle bisher charakterisierten Luciferase-Luciferin-Reaktionen zu einem bestimmten Zeitpunkt molekularen Sauerstoff benötigen .

Bakterielle Luciferase

Auch die durch bakterielle Luciferase katalysierte Reaktion ist ein oxidativer Prozess:

  • FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + Licht

Bei der Reaktion oxidiert molekularer Sauerstoff Flavinmononukleotid und einen langkettigen aliphatischen Aldehyd zu einer aliphatischen Carbonsäure . Die Reaktion bildet ein angeregtes Hydroxyflavin-Zwischenprodukt, das zum Produkt FMN dehydratisiert wird, um blaugrünes Licht zu emittieren.

Fast der gesamte Energieeintrag in die Reaktion wird in Licht umgewandelt. Die Reaktion ist 80 bis 90 % effizient. Im Vergleich dazu wandelt die Glühbirne nur etwa 10 % ihrer Energie in Licht um und eine 150 Lumen pro Watt (lm/W) LED wandelt 20 % der zugeführten Energie in sichtbares Licht um.

Anwendungen

Luciferasen können im Labor gentechnisch zu verschiedenen Zwecken hergestellt werden. Luciferase- Gene können synthetisiert und in Organismen eingefügt oder in Zellen transfiziert werden. Ab 2002 sind Mäuse , Seidenraupen und Kartoffeln nur einige der Organismen, die bereits zur Produktion des Proteins entwickelt wurden.

Bei der Luciferase-Reaktion wird Licht emittiert, wenn Luciferase auf das entsprechende Luciferin- Substrat einwirkt . Photonenemission kann durch lichtempfindliche Geräte wie ein Luminometer oder modifizierte optische Mikroskope nachgewiesen werden . Dies ermöglicht die Beobachtung biologischer Prozesse. Da für die Luciferase-Biolumineszenz keine Lichtanregung erforderlich ist, gibt es eine minimale Autofluoreszenz und damit eine praktisch hintergrundfreie Fluoreszenz. Daher können mit einem Standard- Szintillationszähler nur noch 0,02 pg genau gemessen werden .

In der biologischen Forschung wird Luciferase üblicherweise als Reporter verwendet, um die Transkriptionsaktivität in Zellen zu beurteilen, die mit einem genetischen Konstrukt transfiziert sind, das das Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines interessierenden Promotors enthält . Darüber hinaus können prolumineszente Moleküle, die bei Aktivität eines bestimmten Enzyms in Luciferin umgewandelt werden, verwendet werden, um die Enzymaktivität in gekoppelten oder zweistufigen Luciferase-Assays nachzuweisen. Solche Substrate wurden unter anderem verwendet, um Caspase- Aktivität und Cytochrom-P450- Aktivität nachzuweisen .

Luziferase kann auch den Grad der zellulären ATP in der Lebensfähigkeit der Zellen zu erfassen , verwendet werden , Assays oder für Kinase - Aktivitätsassays. Luciferase kann durch Biotinylierung als ATP-Sensorprotein fungieren . Biotinylierung wird durch Bindung an eine Luciferase auf der Zelloberfläche immobilisieren Streptavidin - Biotin - Komplex. Dies ermöglicht es Luciferase, den Ausfluss von ATP aus der Zelle zu erkennen und die Echtzeit-Freisetzung von ATP durch Biolumineszenz effektiv anzuzeigen. Luziferase kann zusätzlich für die ATP - Nachweis empfindlicher gemacht werden , indem die Lumineszenzintensität zu erhöhen , indem bestimmte ändernden Aminosäurereste in der Sequenz des Proteins.

Die Bildgebung ganzer Tiere (im Leben als in vivo bezeichnet oder auch als ex vivo- Bildgebung bezeichnet) ist eine leistungsfähige Technik zum Untersuchen von Zellpopulationen in lebenden Tieren, wie beispielsweise Mäusen. Verschiedene Zelltypen (z. B. Knochenmarkstammzellen, T-Zellen) können so konstruiert werden, dass sie eine Luciferase exprimieren, was ihre nicht-invasive Visualisierung im Inneren eines lebenden Tieres mit einer empfindlichen Kamera mit ladungsgekoppeltem Gerät ( CCD-Kamera ) ermöglicht. Diese Technik wurde verwendet um die Tumorentstehung und das Ansprechen von Tumoren auf die Behandlung in Tiermodellen zu verfolgen. Umweltfaktoren und therapeutische Interferenzen können jedoch in Bezug auf Veränderungen der proliferativen Aktivität zu einigen Diskrepanzen zwischen der Tumorbelastung und der Biolumineszenzintensität führen. Die Intensität des Signals gemessen durch in - vivo - Bildgebung kann von verschiedenen Faktoren abhängen, wie D-Luciferin - Absorption durch das Peritoneum, Blutfluß, Zellmembranpermeabilität, die Verfügbarkeit von Cofaktoren, intrazellulären pH und der Transparenz des Gewebe überlagert, zusätzlich zu die Menge an Luciferase.

Luciferase ist ein hitzeempfindliches Protein, das in Studien zur Proteindenaturierung verwendet wird , um die Schutzkapazitäten von Hitzeschockproteinen zu testen . Die Möglichkeiten zur Verwendung von Luciferase erweitern sich weiter.

Siehe auch

Verweise

Externe Links

Dieser Artikel enthält gemeinfreien Text von Pfam und InterPro : IPR018804
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