N-Acylphosphatidylethanolamin-spezifische Phospholipase D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-Acylphosphatidylethanolaminphospholipase D
Identifikatoren
Symbol NAPEPLD
NCBI-Gen 222236
HGNC 21683
OMIM 612334
PDB 4QN9
RefSeq NM_001122838
UniProt Q6IQ20
Andere Daten
EG-Nummer 3.1.4.54
Ort Chr. 7 q22.1

N-Acylphosphatidylethanolaminphospholipase D ( NAPE-PLD ) ist ein Enzym , das die Freisetzung von N-Acylethanolamin (NAE) aus N-Acylphosphatidylethanolamin (NAPE) katalysiert . Dies ist ein wichtiger Teil des Prozesses, der gewöhnliche Lipide in chemische Signale wie Anandamid und Oleoylethanolamin umwandelt . Beim Menschen wird das NAPE-PLD-Protein vom NAPEPLD- Gen kodiert .

Entdeckung

NAPE-PLD ist eine Enzymaktivität – eine Phospholipase , die auf Phospholipide in der Zellmembran einwirkt . Es ist nicht Homologie, sondern das chemische Ergebnis seiner Aktivität, das es als Phospholipase D klassifiziert . Die enzymatische Aktivität wurde in einer Reihe von Experimenten entdeckt und charakterisiert, die in der Veröffentlichung eines biochemischen Reinigungsschemas im Jahr 2004 gipfelten, mit dem eine Peptidsequenzierung durchgeführt werden konnte. Forscher homogenisiert Herzen von 150 Ratten (fein gemahlen) , und die sich ergebende unterzogen Rohlysat zu Saccharose Sedimentation bei 105.000 × g , um die Zellmembranen von dem Rest der Zelle abscheiden. Die integralen Membranproteine wurden dann unter Verwendung von Octylglucosid solubilisiert und vier Säulenchromatographieschritten unterzogen (HiTrap SP HP Kationenaustauschersäule, HiTrap Q Anionenaustauschersäule, HiTrap Blue Affinitätssäule, Bio-Gel HTP Hydroxyapatitsäule). Jeder von ihnen trennt die verschiedenen Arten von Membranproteinen in verschiedene Probenbehälter, wenn die Proteine im Laufe der Zeit von der Säule eluiert werden, und durch Messung der Aktivität der Proben in jedem Behälter war es möglich, zu verfolgen, welche das aktive Enzym erhielten. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte durch Dünnschichtchromatographie eines radioaktiven Substrats, das gegenüber der enzymatischen Aktivität von NAPE-PLD empfindlich ist: Die Spaltung des Substrats beeinflusste dort, wo es auf der Platte erschien, als die Strahlung auf einem Bioimaging-Analysator nachgewiesen wurde.

Das Ergebnis dieses umfangreichen Verfahrens war immer noch kein reines Protein, aber es produzierte eine begrenzte Anzahl von Banden durch SDS-PAGE , und es wurde gefunden , dass eine Bande von 46 Kilodalton in ihrer Intensität mit der enzymatischen Aktivität korreliert. Diese Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit Trypsin verdaut , und Peptide davon wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie voneinander getrennt . Die resultierenden Fragmente wurden dann durch einen automatisierten Edman-Abbau mikrosequenziert . Drei entsprachen Vimentin , einem intermediären Filamentprotein von 56 kDa, von dem angenommen wird, dass es eine Verunreinigung ist, und die anderen beiden stimmten mit dem cDNA-Klon überein, der anschließend als NAPE-PLD identifiziert wurde.

Nachdem dieser Hinweis gefunden war, konnte die Identifizierung durch ein weniger aufwendiges Verfahren bestätigt werden: Die Überexpression der mutmaßlichen NAPE-PLD-cDNA in COS-7-Zellen ergab eine starke enzymatische Aktivität von NAPE-PLD, deren Eigenschaften denen von der ursprüngliche Herzextrakt.

Eigenschaften

Die NAPEPLD- cDNA- Sequenz sagt 396 Aminosäuresequenzen sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten voraus , die zu 89% und 90% mit denen des Menschen identisch sind. Es wurde festgestellt, dass NAPE-PLD keine Homologie zu den bekannten Phospholipase-D- Genen aufweist, aber durch Homologie in die Zink- Metallohydrolase- Familie der Beta-Lactamase-Faltung eingeordnet werden kann . Insbesondere wurde das hochkonservierte Motiv H X( E / H )X D ( C / R / S / H )X 50–70 H X 15–30 ( C / S / D )X 30–70 H beobachtet, das ist im Allgemeinen mit der Zinkbindungs- und Hydrolysereaktion in dieser Proteinklasse verbunden, was die Autoren zu dem Vorschlag veranlasst, dass die Aktivität mit dem Zinkgehalt korreliert werden sollte.

Wenn rekombinantes NAPE-PLD in vitro in COS-Zellen getestet wurde, hatte es eine ähnliche Aktivität gegenüber mehreren radioaktiv markierten Substraten: N-Palmitoylphosphatidylethanolamin, N-Arachidonoylphosphatidylethanolamin, N-Oleoylphosphatidylethanolamin und N-Stearoylphosphatidylethanolamin reagierten alle mit einem K m zwischen 2–4 mikromolar und a V max zwischen 73 und 101 Nanomol pro Milligramm pro Minute, wie durch das Lineweaver-Burk-Diagramm berechnet . (Diese erzeugen N- Palmitoylethanolamin , Anandamid , N- Oleoylethanolamin bzw. N-Stearoylethanolamin) Das Enzym reagierte auch N-Palmitoyl-lyso-phosphatidylethanolamin und N-Arachidonoyl-lyso-phosphatidylethanolamin mit ähnlichem K m, aber bei einem Drittel zu eins -Vierter der V max . Diese Aktivitäten stimmen mit der Beobachtung überein, dass viele Gewebe eine Reihe von N- Acylethanolaminen produzieren .

NAPE-PLD hatte jedoch keine Fähigkeit, nachweisbare Phosphatidsäure aus Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin zu produzieren, wie es durch andere Phospholipase-D- Enzyme katalysiert wird . Es fehlt auch die Transphosphatidylierungsaktivität von Phospholipase D, die die Bildung von Phosphatidylalkoholen anstelle von Phosphatidsäure in Gegenwart von Ethanol oder Butanol ermöglicht .

Weg

Dieses Enzym fungiert als zweiter Schritt eines biochemischen Stoffwechselwegs, der durch die Bildung von N-Acylphosphatidylethanolamin durch die Übertragung einer Acylgruppe von der sn- 1-Position von Glycerophospholipid auf die Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin eingeleitet wird . Während NAPE-PLD zur Biosynthese mehrerer NAE im zentralen Nervensystem von Säugetieren beiträgt , ist nicht klar, ob dieses Enzym nicht für die Bildung des Endocannabinoids Anandamid verantwortlich ist , da von NAPE-PLD- Knockout-Mäusen berichtet wurde, dass sie Wildtyp- oder sehr reduzierte Anandamidspiegel.

Die von diesem Enzym freigesetzten N-Acylethanolamine werden potenzielle Substrate für die Fettsäureamidhydrolase (FAAH), die die freien Fettsäuren aus Ethanolamin hydrolysiert . Defekte in diesem Enzym können dazu führen, dass NAPE-PLD-Produkte wie Anandamid bis zu 15-fach höher als normalerweise beobachtet werden.

Struktur

Dieses Membranenzym bildet Homodimere , die teilweise durch einen internen 9-Å-breiten Kanal getrennt sind. Die Metallo Beta-Lactamase Proteinfaltung wird assoziieren mit Membran angepasst Phospholipide . Ein hydrophober Hohlraum bietet dem Substrat NAPE einen Zugang zum aktiven Zentrum, wo ein zweikerniges Zinkzentrum seine Hydrolyse katalysiert. Gallensäuren binden mit hoher Affinität an selektive Taschen in diesem Hohlraum, wodurch die Dimeranordnung verbessert und die Katalyse ermöglicht wird. NAPE-PLD erleichtert das Übersprechen zwischen Gallensäuresignalen und Lipidamidsignalen.

Verweise