Optisches Mikroskop - Optical microscope

Ein modernes optisches Mikroskop mit einer Quecksilberbirne für die Fluoreszenzmikroskopie . Das Mikroskop verfügt über eine Digitalkamera, die an einen Computer angeschlossen ist .

Das optische Mikroskop , auch als Lichtmikroskop bezeichnet , ist eine Art Mikroskop , das gewöhnlich sichtbares Licht und ein Linsensystem verwendet , um vergrößerte Bilder von kleinen Objekten zu erzeugen. Optische Mikroskope sind die älteste Mikroskopbauart und wurden möglicherweise im 17. Jahrhundert in ihrer heutigen zusammengesetzten Form erfunden. Grundlegende optische Mikroskope können sehr einfach sein, obwohl viele komplexen Designs zu verbessern Ziel Auflösung und Proben Kontrast .

Das Objekt wird auf einem Tisch platziert und kann direkt durch ein oder zwei Okulare am Mikroskop betrachtet werden. Bei Hochleistungsmikroskopen zeigen beide Okulare typischerweise das gleiche Bild, bei einem Stereomikroskop werden jedoch leicht unterschiedliche Bilder verwendet, um einen 3D-Effekt zu erzeugen. Normalerweise wird eine Kamera verwendet, um das Bild ( Mikrobild ) aufzunehmen.

Die Probe kann auf verschiedene Weise beleuchtet werden. Transparente Objekte können von unten beleuchtet werden und feste Objekte können mit Licht beleuchtet werden, das durch ( Hellfeld ) oder um ( Dunkelfeld ) die Objektivlinse einfällt. Polarisiertes Licht kann verwendet werden, um die Kristallorientierung von metallischen Objekten zu bestimmen. Phasenkontrast-Bildgebung kann verwendet werden, um den Bildkontrast zu erhöhen, indem kleine Details mit unterschiedlichem Brechungsindex hervorgehoben werden.

Eine Reihe von Objektivlinsen mit unterschiedlichen Vergrößerungen sind in der Regel auf einem Revolverkopf montiert ist vorgesehen, so dass sie an Ort und Stelle und bietet die Fähigkeit , gedreht werden , um Zoom-in. Die maximale Vergrößerungsleistung optischer Mikroskope ist aufgrund des begrenzten Auflösungsvermögens des sichtbaren Lichts typischerweise auf etwa das 1000-fache begrenzt. Die Vergrößerung eines zusammengesetzten optischen Mikroskops ist das Produkt der Vergrößerung des Okulars (z. B. 10x) und der Objektivlinse (z. B. 100x), um eine Gesamtvergrößerung von 1.000x zu erhalten. Veränderte Umgebungen wie die Verwendung von Öl oder ultraviolettem Licht können die Vergrößerung erhöhen.

Alternativen zur optischen Mikroskopie, die kein sichtbares Licht verwenden, umfassen Rasterelektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie und Rastersondenmikroskopie und können als Ergebnis viel größere Vergrößerungen erzielen.

Typen

Schema eines einfachen Mikroskops

Es gibt zwei grundlegende Arten von optischen Mikroskopen: einfache Mikroskope und zusammengesetzte Mikroskope. Ein einfaches Mikroskop nutzt die optische Leistung einer einzelnen Linse oder einer Linsengruppe zur Vergrößerung. Ein zusammengesetztes Mikroskop verwendet ein Linsensystem (ein Satz vergrößert das erzeugte Bild durch einen anderen), um eine viel höhere Vergrößerung eines Objekts zu erzielen. Die überwiegende Mehrheit der modernen Forschungsmikroskope sind zusammengesetzte Mikroskope, während einige billigere kommerzielle Digitalmikroskope einfache Einlinsenmikroskope sind. Verbundmikroskope können weiter in eine Vielzahl anderer Arten von Mikroskopen unterteilt werden, die sich in ihren optischen Konfigurationen, Kosten und beabsichtigten Zwecken unterscheiden.

Einfaches Mikroskop

Ein einfaches Mikroskop verwendet eine Linse oder einen Linsensatz, um ein Objekt allein durch Winkelvergrößerung zu vergrößern, sodass der Betrachter ein aufrechtes vergrößertes virtuelles Bild erhält . Die Verwendung einer einzelnen konvexen Linse oder Linsengruppen findet sich in einfachen Vergrößerungsgeräten wie Lupen , Lupen und Okularen für Teleskope und Mikroskope.

Verbundmikroskop

Schema eines zusammengesetzten Mikroskops

Eine Verbindung Mikroskop verwendet eine Linse nahe dem Objekt zu sammeln Licht betrachtet wird (die genannte Objektivlinse) , die einen Schwerpunkt reelles Bild im Inneren des Mikroskops (Bild 1) des Objekts. Dieses Bild wird dann durch eine zweite Linse oder Linsengruppe (das Okular genannt ) vergrößert, die dem Betrachter ein vergrößertes umgekehrtes virtuelles Bild des Objekts (Bild 2) gibt. Die Verwendung einer zusammengesetzten Objektiv/Okular-Kombination ermöglicht eine viel höhere Vergrößerung. Gängige Verbundmikroskope verfügen häufig über austauschbare Objektivlinsen, mit denen der Benutzer die Vergrößerung schnell anpassen kann. Ein zusammengesetztes Mikroskop ermöglicht auch fortschrittlichere Beleuchtungskonfigurationen, wie z. B. den Phasenkontrast .

Andere Mikroskopvarianten

Es gibt viele Varianten des zusammengesetzten optischen Mikroskopdesigns für spezielle Zwecke. Einige davon sind physische Designunterschiede, die eine Spezialisierung für bestimmte Zwecke ermöglichen:

  • Stereomikroskop , ein Mikroskop mit geringer Leistung, das eine stereoskopische Ansicht der Probe bietet, das üblicherweise für die Dissektion verwendet wird.
  • Vergleichsmikroskop , das über zwei getrennte Lichtwege verfügt, die den direkten Vergleich zweier Proben über ein Bild in jedem Auge ermöglichen.
  • Inverses Mikroskop , um Proben von unten zu untersuchen; nützlich für Zellkulturen in Flüssigkeit oder für die Metallographie.
  • Mikroskop zur Inspektion von faseroptischen Steckverbindern, entwickelt für die Inspektion der Steckverbinderstirnfläche
  • Wandermikroskop zur Untersuchung von Proben mit hoher optischer Auflösung .

Andere Mikroskopvarianten sind für unterschiedliche Beleuchtungstechniken ausgelegt:

  • Petrographisches Mikroskop , dessen Design normalerweise einen Polarisationsfilter, einen Drehtisch und eine Gipsplatte umfasst, um die Untersuchung von Mineralien oder anderen kristallinen Materialien zu erleichtern, deren optische Eigenschaften mit der Ausrichtung variieren können.
  • Polarisationsmikroskop , ähnlich dem petrographischen Mikroskop.
  • Phasenkontrastmikroskop , das die Phasenkontrastbeleuchtungsmethode anwendet.
  • Epifluoreszenzmikroskop , entwickelt für die Analyse von Proben, die Fluorophore enthalten.
  • Konfokales Mikroskop , eine weit verbreitete Variante der Epifluoreszenzbeleuchtung, die einen Scanning-Laser verwendet, um eine Probe für die Fluoreszenz zu beleuchten.
  • Zwei-Photonen-Mikroskop , das verwendet wird, um Fluoreszenz in streuenden Medien tiefer abzubilden und das Photobleichen, insbesondere in lebenden Proben, zu reduzieren.
  • Schülermikroskop – ein Mikroskop mit oft geringer Leistung mit vereinfachter Bedienung und manchmal minderwertiger Optik, das für den Schulgebrauch oder als Einsteigerinstrument für Kinder entwickelt wurde.
  • Ultramikroskop , ein angepasstes Lichtmikroskop, das Lichtstreuung verwendet , um die Betrachtung winziger Partikel zu ermöglichen, deren Durchmesser unter oder nahe der Wellenlänge des sichtbaren Lichts (etwa 500 Nanometer) liegt; seit dem Aufkommen der Elektronenmikroskope weitgehend veraltet
  • Das spitzenverstärkte Raman-Mikroskop ist eine Variante des optischen Mikroskops, das auf der spitzenverstärkten Raman-Spektroskopie ohne traditionelle wellenlängenbasierte Auflösungsgrenzen basiert. Dieses Mikroskop wird hauptsächlich auf den Rastersondenmikroskop- Plattformen mit allen optischen Werkzeugen realisiert.

Digitales Mikroskop

Ein Miniatur- USB-Mikroskop .

Ein Digitalmikroskop ist ein Mikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, mit der eine Probe über einen Computer beobachtet werden kann . Mikroskope können auch teilweise oder vollständig computergesteuert mit verschiedenen Automatisierungsgraden sein. Die digitale Mikroskopie ermöglicht eine umfassendere Analyse eines Mikroskopbildes, beispielsweise die Messung von Abständen und Flächen und die Quantifizierung einer fluoreszierenden oder histologischen Färbung.

Digitalmikroskope mit geringer Leistung, USB-Mikroskope , sind ebenfalls im Handel erhältlich. Dies sind im Wesentlichen Webcams mit einem leistungsstarken Makroobjektiv und verwenden im Allgemeinen kein Durchlicht . Die Kamera wird direkt an den USB- Port eines Computers angeschlossen, sodass die Bilder direkt auf dem Monitor angezeigt werden. Sie bieten bescheidene Vergrößerungen (bis ca. 200×) ohne Okulare und das zu sehr geringen Kosten. Eine Hochleistungsbeleuchtung wird normalerweise durch eine LED- Quelle oder Quellen neben dem Kameraobjektiv bereitgestellt .

Digitalmikroskopie mit sehr geringen Lichtstärken zur Vermeidung von Schäden an empfindlichen biologischen Proben ist mit empfindlichen Photonen zählenden Digitalkameras verfügbar . Es wurde gezeigt, dass eine Lichtquelle, die Paare verschränkter Photonen liefert , das Risiko einer Beschädigung der lichtempfindlichsten Proben minimieren kann. Bei dieser Anwendung von Ghost Imaging auf die Photonensparse-Mikroskopie wird die Probe mit Infrarotphotonen beleuchtet, von denen jedes räumlich mit einem verschränkten Partner im sichtbaren Band korreliert ist, um eine effiziente Abbildung durch eine Photonenzählkamera zu ermöglichen.

Geschichte

Erfindung

Die frühesten Mikroskope waren einlinsige Lupen mit begrenzter Vergrößerung, die mindestens bis zur weit verbreiteten Verwendung von Linsen in Brillen im 13. Jahrhundert zurückreichen .

Zusammengesetzte Mikroskope erschienen erstmals um 1620 in Europa, darunter eines von Cornelis Drebbel in London (um 1621) und eines, das 1624 in Rom ausgestellt wurde.

Der eigentliche Erfinder des zusammengesetzten Mikroskops ist unbekannt, obwohl im Laufe der Jahre viele Behauptungen aufgestellt wurden. Dazu gehört die Behauptung des niederländischen Brillenmachers Johannes Zachariassen, 35 Jahre nach ihrem Erscheinen, dass sein Vater Zacharias Janssen bereits 1590 das zusammengesetzte Mikroskop und/oder das Teleskop erfunden habe Dass Zacharias damals noch ein Kind gewesen war, führte zu Spekulationen, dass für Johannes' Behauptung das zusammengesetzte Mikroskop von Johannes' Großvater Hans Martens erfunden worden sein müsste. Eine andere Behauptung ist, dass Janssens Konkurrent Hans Lippershey (der 1608 das erste Teleskop-Patent anmeldete) auch das zusammengesetzte Mikroskop erfunden hat. Andere Historiker verweisen auf den niederländischen Erfinder Cornelis Drebbel mit seinem 1621 zusammengesetzten Mikroskop.

Galileo Galilei wird manchmal auch als Erfinder des zusammengesetzten Mikroskops genannt. Nach 1610 stellte er fest, dass er sein Teleskop nahe fokussieren konnte, um kleine Objekte wie Fliegen aus der Nähe zu betrachten und/oder durch das falsche Ende in umgekehrter Richtung zu sehen, um kleine Objekte zu vergrößern. Der einzige Nachteil war, dass sein 2 Fuß langes Teleskop auf 6 Fuß ausgefahren werden musste, um Objekte so nahe zu betrachten. Nachdem er das 1624 in Rom ausgestellte zusammengesetzte Mikroskop von Drebbel gesehen hatte, baute Galileo seine eigene verbesserte Version. 1625 prägte Giovanni Faber den Namen Mikroskop für das zusammengesetzte Mikroskop, das Galileo 1624 der Accademia dei Lincei vorlegte (Galileo hatte es das „ occhiolino “ oder „ kleines Auge “) genannt. Faber prägte den Namen aus den griechischen Wörtern μικρόν (Mikron) für „klein“ und σκοπεῖν (skopein) für „anschauen“, ein Name, der analog zu „ Teleskop “ sein soll, einem anderen Wort, das von den Linceanern geprägt wurde.

Christiaan Huygens , ein anderer Holländer, entwickelte eine einfache 2-Objektiv Okularsystem im späten 17. Jahrhundert , die wurde achromatisch korrigiert und damit einen großen Schritt vorwärts in Mikroskop Entwicklung. Das Huygens-Okular wird bis heute produziert, leidet aber unter einer kleinen Feldgröße und anderen kleinen Nachteilen.

Popularisierung

Das älteste veröffentlichte Bild, das bekanntermaßen mit einem Mikroskop aufgenommen wurde: Bienen von Francesco Stelluti , 1630

Antonie van Leeuwenhoek (1632–1724) wird zugeschrieben, Biologen auf das Mikroskop aufmerksam gemacht zu haben, obwohl bereits im 16. Jahrhundert einfache Lupen hergestellt wurden. Van Leeuwenhoeks selbstgebaute Mikroskope waren einfache Mikroskope mit einer einzigen sehr kleinen, aber starken Linse. Sie waren umständlich im Gebrauch, ermöglichten van Leeuwenhoek jedoch, detaillierte Bilder zu sehen. Es dauerte etwa 150 Jahre optischer Entwicklung, bis das zusammengesetzte Mikroskop aufgrund der Schwierigkeiten bei der Konfiguration mehrerer Linsen die gleiche Bildqualität liefern konnte wie die einfachen Mikroskope von van Leeuwenhoek. In den 1850er Jahren erfand John Leonard Riddell , Professor für Chemie an der Tulane University , das erste praktische binokulare Mikroskop, während er eine der frühesten und umfangreichsten amerikanischen mikroskopischen Untersuchungen der Cholera durchführte .

Beleuchtungstechniken

Während grundlegende Mikroskoptechnologie und Optik seit über 400 Jahren verfügbar sind, wurden erst in jüngerer Zeit Techniken der Probenbeleuchtung entwickelt, um die heute gesehenen hochwertigen Bilder zu erzeugen.

Im August 1893 entwickelte August Köhler die Köhlersche Beleuchtung . Diese Methode der Probenbeleuchtung führt zu einer extrem gleichmäßigen Beleuchtung und überwindet viele Einschränkungen älterer Techniken der Probenbeleuchtung. Vor der Entwicklung der Köhlerschen Beleuchtung war im Probenbild immer das Bild der Lichtquelle, beispielsweise eines Glühfadens, sichtbar.

Der Nobelpreis für Physik wurde 1953 dem niederländischen Physiker Frits Zernike für seine Entwicklung der Phasenkontrastbeleuchtung verliehen , die die Abbildung transparenter Proben ermöglicht. Durch die Verwendung von Interferenz statt Absorption von Licht, extrem transparenten Proben wie lebenden Säugerzellen, können ohne abgebildet werden Anfärben Techniken zu verwenden. Nur zwei Jahre später, 1955, veröffentlichte Georges Nomarski die Theorie der Differentialinterferenzkontrastmikroskopie , einer weiteren interferenzbasierten Bildgebungstechnik.

Fluoreszenzmikroskopie

Die moderne biologische Mikroskopie hängt stark von der Entwicklung fluoreszierender Sonden für spezifische Strukturen innerhalb einer Zelle ab. Im Gegensatz zur normalen Durchlichtmikroskopie wird bei der Fluoreszenzmikroskopie die Probe durch die Objektivlinse mit einem schmalen Satz von Lichtwellenlängen beleuchtet. Dieses Licht wechselwirkt mit Fluorophoren in der Probe, die dann Licht längerer Wellenlänge emittieren . Dieses emittierte Licht bildet das Bild.

Seit Mitte des 20. Jahrhunderts werden chemisch fluoreszierende Farbstoffe, wie DAPI , das an DNA bindet , verwendet, um spezifische Strukturen innerhalb der Zelle zu markieren. Neuere Entwicklungen umfassen Immunfluoreszenz , die fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet , um spezifische Proteine ​​in einer Probe zu erkennen, und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP, die eine lebende Zelle exprimieren kann , wodurch sie fluoresziert wird.

Komponenten

Grundelemente des optischen Transmissionsmikroskops (1990er Jahre)

Alle modernen optischen Mikroskope, die für die Betrachtung von Proben im Durchlicht konzipiert sind, haben die gleichen Grundkomponenten des Strahlengangs. Darüber hinaus haben die allermeisten Mikroskope die gleichen „strukturellen“ Komponenten (unten nummeriert gemäß der Abbildung rechts):

  • Okular (Okularlinse) (1)
  • Objektivrevolver, Revolver oder Objektivrevolver (zur Aufnahme mehrerer Objektive) (2)
  • Objektive (3)
  • Fokusknöpfe (um die Bühne zu bewegen)
    • Grobeinstellung (4)
    • Feineinstellung (5)
  • Bühne (zum Halten der Probe) (6)
  • Lichtquelle (ein Licht oder ein Spiegel ) (7)
  • Membran und Kondensator (8)
  • Mechanischer Tisch (9)

Okular (Okularlinse)

Das Okular oder die Okularlinse ist ein Zylinder, der zwei oder mehr Linsen enthält; seine Funktion besteht darin, das Bild für das Auge scharf zu stellen. Das Okular wird in das obere Ende des Körpertubus eingesetzt. Okulare sind austauschbar und es können viele verschiedene Okulare mit unterschiedlichen Vergrößerungsgraden eingesetzt werden. Typische Vergrößerungswerte für Okulare sind 5×, 10× (am häufigsten), 15× und 20×. Bei einigen Hochleistungsmikroskopen sind die optische Konfiguration von Objektivlinse und Okular aufeinander abgestimmt, um die bestmögliche optische Leistung zu erzielen. Dies tritt am häufigsten bei apochromatischen Objektiven auf.

Objektivrevolver (Revolver oder Revolver)

Objektivrevolver, Revolver oder Objektivrevolver ist der Teil, der den Satz Objektivlinsen hält. Es ermöglicht dem Benutzer, zwischen Objektiven zu wechseln.

Objektivlinse

Am unteren Ende eines typischen zusammengesetzten optischen Mikroskops befinden sich eine oder mehrere Objektivlinsen , die Licht von der Probe sammeln. Das Objektiv befindet sich normalerweise in einem Zylindergehäuse, das eine Einzel- oder Mehrelement-Verbundlinse aus Glas enthält. Typischerweise werden etwa drei Objektivlinsen in ein kreisförmiges Nasenstück eingeschraubt, das gedreht werden kann, um die erforderliche Objektivlinse auszuwählen. Diese Anordnungen sind parfokal ausgelegt, dh beim Wechsel von einer Linse zur anderen am Mikroskop bleibt die Probe im Fokus . Mikroskopobjektive zeichnen sich durch zwei Parameter aus, nämlich Vergrößerung und numerische Apertur . Ersteres reicht typischerweise von 5× bis 100×, während letzteres von 0,14 bis 0,7 reicht, entsprechend Brennweiten von jeweils etwa 40 bis 2 mm. Objektive mit höheren Vergrößerungen haben normalerweise eine höhere numerische Apertur und eine kürzere Schärfentiefe im resultierenden Bild. Einige Hochleistungsobjektive erfordern möglicherweise abgestimmte Okulare, um die beste optische Leistung zu erzielen.

Ölimmersionsobjektiv

Zwei Leica Ölimmersionsmikroskop- Objektive: 100× (links) und 40× (rechts)

Einige Mikroskope verwenden Ölimmersionsobjektive oder Wasserimmersionsobjektive für eine höhere Auflösung bei hoher Vergrößerung. Diese werden mit Index-Matching-Material wie Immersionsöl oder Wasser und einem passenden Deckglas zwischen Objektiv und Probe verwendet. Der Brechungsindex des Indexanpassungsmaterials ist höher als der von Luft, wodurch die Objektivlinse eine größere numerische Apertur (größer als 1) aufweisen kann, so dass das Licht mit minimaler Brechung von der Probe zur Außenfläche der Objektivlinse übertragen wird. Numerische Aperturen bis zu 1,6 können erreicht werden. Die größere numerische Apertur ermöglicht das Sammeln von mehr Licht, wodurch eine detaillierte Beobachtung kleinerer Details möglich wird. Ein Ölimmersionsobjektiv hat normalerweise eine Vergrößerung von 40 bis 100x.

Fokusknöpfe

Einstellknöpfe bewegen den Tisch nach oben und unten mit separater Einstellung für Grob- und Feinfokussierung. Mit den gleichen Bedienelementen kann sich das Mikroskop auf unterschiedlich dicke Proben einstellen. Bei älteren Mikroskopkonstruktionen bewegen die Fokuseinstellräder den Mikroskoptubus relativ zum Stativ nach oben oder unten und hatten einen festen Tisch.

Rahmen

Die gesamte optische Baugruppe ist traditionell an einem starren Arm befestigt, der wiederum an einem robusten U-förmigen Fuß befestigt ist, um die erforderliche Steifigkeit bereitzustellen. Der Armwinkel kann einstellbar sein, damit der Betrachtungswinkel eingestellt werden kann.

Der Rahmen bietet einen Befestigungspunkt für verschiedene Mikroskopsteuerungen. Normalerweise umfasst dies Steuerelemente zum Fokussieren, typischerweise ein großes Rändelrad zum Einstellen des Grobfokus, zusammen mit einem kleineren Rändelrad zum Steuern des Feinfokus. Andere Merkmale können Lampensteuerungen und/oder Steuerungen zum Einstellen des Kondensors sein.

Bühne

Der Objekttisch ist eine Plattform unter der Objektivlinse, die die betrachtete Probe trägt. In der Mitte des Objekttisches befindet sich ein Loch, durch das Licht hindurchtritt, um die Probe zu beleuchten. Der Objekttisch hat in der Regel Arme zur Aufnahme von Objektträgern (rechteckige Glasplatten mit typischen Abmessungen von 25 x 75 mm, auf denen die Probe montiert ist).

Bei Vergrößerungen über 100x ist das Verschieben eines Dias von Hand nicht praktikabel. Ein mechanischer Tisch, typisch für mittel- und höherpreisige Mikroskope, ermöglicht winzige Bewegungen des Objektträgers über Bedienknöpfe, die die Probe/den Objektträger nach Wunsch neu positionieren. Wenn ein Mikroskop ursprünglich keinen Kreuztisch hatte, ist es möglich, einen hinzuzufügen.

Alle Stufen bewegen sich zum Fokussieren nach oben und unten. Bei einem mechanischen Objekttisch bewegen sich die Objektträger auf zwei horizontalen Achsen, um die Probe zu positionieren, um Probendetails zu untersuchen.

Die Fokussierung beginnt bei geringerer Vergrößerung, um die Probe durch den Benutzer auf dem Tisch zu zentrieren. Das Verschieben zu einer höheren Vergrößerung erfordert, dass der Objekttisch vertikal höher bewegt wird, um bei der höheren Vergrößerung neu zu fokussieren, und kann auch eine geringfügige horizontale Anpassung der Objektposition erfordern. Horizontale Anpassungen der Objektposition sind der Grund für den Einsatz eines Kreuztisches.

Aufgrund der Schwierigkeit, Präparate vorzubereiten und auf Objektträger zu montieren, ist es für Kinder am besten, mit vorbereiteten Objektträgern zu beginnen, die zentriert sind und unabhängig von der verwendeten Fokusstufe leicht fokussieren.

Lichtquelle

Viele Lichtquellen können verwendet werden. Im einfachsten Fall wird das Tageslicht über einen Spiegel geleitet . Die meisten Mikroskope verfügen jedoch über eine eigene einstellbare und steuerbare Lichtquelle – oft eine Halogenlampe , obwohl die Beleuchtung mit LEDs und Lasern immer häufiger vorkommt. Bei teureren Instrumenten wird häufig eine Köhler-Beleuchtung bereitgestellt.

Kondensator

Der Kondensor ist eine Linse, die dazu dient, Licht von der Beleuchtungsquelle auf die Probe zu fokussieren. Der Kondensor kann auch andere Merkmale umfassen, wie beispielsweise eine Blende und/oder Filter, um die Qualität und Intensität der Beleuchtung zu steuern. Für Beleuchtungstechniken wie Dunkelfeld- , Phasenkontrast- und Differenzial-Interferenzkontrast- Mikroskopie müssen zusätzliche optische Komponenten genau im Strahlengang ausgerichtet werden.

Vergrößerung

Die tatsächliche Stärke oder Vergrößerung eines zusammengesetzten optischen Mikroskops ist das Produkt der Stärke des Okulars ( Okulars ) und der Objektivlinse. Die maximale Normalvergrößerung von Okular und Objektiv beträgt 10x bzw. 100x, was eine Endvergrößerung von 1.000x ergibt.

Vergrößerung und mikroskopische Aufnahmen

Bei Verwendung einer Kamera zur Aufnahme einer mikroskopischen Aufnahme muss die effektive Vergrößerung des Bildes die Größe des Bildes berücksichtigen. Dies ist unabhängig davon, ob es sich um einen Abzug von einem Filmnegativ handelt oder digital auf einem Computerbildschirm angezeigt wird .

Bei fotografischen Filmkameras ist die Rechnung einfach; die Endvergrößerung ist das Produkt aus: der Objektivlinsenvergrößerung, der Kameraoptikvergrößerung und dem Vergrößerungsfaktor des Filmabzugs relativ zum Negativ. Ein typischer Wert des Vergrößerungsfaktors liegt bei etwa 5× (bei 35 mm Film und 15 × 10 cm (6 × 4 Zoll) Print).

Bei Digitalkameras müssen die Pixelgröße im CMOS- oder CCD- Detektor und die Pixelgröße auf dem Bildschirm bekannt sein. Der Vergrößerungsfaktor vom Detektor zu den Pixeln auf dem Bildschirm kann dann berechnet werden. Wie bei einer Filmkamera ist die endgültige Vergrößerung das Produkt aus: der Objektivlinsenvergrößerung, der Kameraoptikvergrößerung und dem Vergrößerungsfaktor.

Betrieb

Beleuchtungstechniken

Es sind viele Techniken verfügbar, die den Lichtweg modifizieren, um ein Bild mit verbessertem Kontrast von einer Probe zu erzeugen . Zu den wichtigsten Techniken zum Erzeugen eines erhöhten Kontrasts aus der Probe gehören kreuzpolarisiertes Licht , Dunkelfeld , Phasenkontrast und differentielle Interferenzkontrastbeleuchtung . Eine neuere Technik ( Sarfus ) kombiniert kreuzpolarisiertes Licht und spezifische kontrastverstärkte Objektträger zur Visualisierung nanometrischer Proben.

Andere Techniken

Moderne Mikroskope erlauben mehr als nur die Betrachtung des Durchlichtbildes einer Probe; Es gibt viele Techniken, die verwendet werden können, um andere Arten von Daten zu extrahieren. Die meisten davon erfordern neben einem einfachen Verbundmikroskop zusätzliche Ausrüstung.

  • Auflicht oder Auflicht (zur Analyse von Oberflächenstrukturen)
  • Fluoreszenzmikroskopie, beide:
  • Mikrospektroskopie (bei der ein UV-Vis-Spektrophotometer in ein optisches Mikroskop integriert ist)
  • UV-Mikroskopie
  • Nahinfrarot-Mikroskopie
  • Multiple Transmission Mikroskopie zur Kontrastverstärkung und Aberrationsreduzierung.
  • Automatisierung (zum automatischen Scannen einer großen Probe oder Bildaufnahme)

Anwendungen

Ein Bild mit 40-facher Vergrößerung von Zellen in einem medizinischen Abstrichtest, aufgenommen durch ein optisches Mikroskop unter Verwendung einer Nassmontagetechnik , wobei die Probe auf einen Objektträger gelegt und mit einer Salzlösung vermischt wird

Die optische Mikroskopie wird in großem Umfang in der Mikroelektronik, Nanophysik, Biotechnologie, pharmazeutischen Forschung, Mineralogie und Mikrobiologie eingesetzt.

Die optische Mikroskopie dient der medizinischen Diagnostik , bei Geweben als Histopathologie bezeichnet , oder bei Abstrichuntersuchungen an freien Zellen oder Gewebefragmenten.

Im industriellen Einsatz sind binokulare Mikroskope weit verbreitet. Abgesehen von Anwendungen, die eine echte Tiefenwahrnehmung erfordern , reduziert die Verwendung von Doppelokularen die Augenbelastung, die mit langen Arbeitstagen an einer Mikroskopierstation verbunden ist. In bestimmten Anwendungen sind Mikroskope mit großem Arbeitsabstand oder langem Fokus von Vorteil. Möglicherweise muss ein Gegenstand hinter einem Fenster untersucht werden , oder gewerbliche Gegenstände können eine Gefahr für das Objektiv darstellen. Solche Optiken ähneln Teleskopen mit Nahfokusfähigkeiten.

Zur Präzisionsmessung werden Messmikroskope eingesetzt. Es gibt zwei Grundtypen. Einer hat ein graduiertes Absehen , um Entfernungen in der Fokusebene messen zu können. Der andere (und ältere) Typ hat ein einfaches Fadenkreuz und einen Mikrometermechanismus zum Bewegen des Objekts relativ zum Mikroskop.

Sehr kleine, tragbare Mikroskope haben dort Verwendung gefunden, wo ein Labormikroskop eine Belastung darstellen würde.

Einschränkungen

Die in Stein gemeißelte Beugungsgrenze auf einem Denkmal für Ernst Abbe .

Punktobjekte erscheinen bei sehr hohen Vergrößerungen im Durchlicht als unscharfe Scheiben, die von Beugungsringen umgeben sind. Diese werden Airy-Disks genannt . Unter dem Auflösungsvermögen eines Mikroskops wird die Fähigkeit verstanden, zwischen zwei eng beieinander liegenden Airy-Scheiben zu unterscheiden (oder mit anderen Worten die Fähigkeit des Mikroskops, benachbarte strukturelle Details als deutlich und getrennt sichtbar zu machen). Es sind diese Auswirkungen der Beugung, die die Fähigkeit zur Auflösung feiner Details einschränken. Ausmaß und Größe der Beugungsmuster werden sowohl durch die Wellenlänge des Lichts (λ), die zur Herstellung der Objektivlinse verwendeten Brechungsmaterialien als auch durch die numerische Apertur (NA) der Objektivlinse beeinflusst. Es gibt daher eine endliche Grenze, jenseits derer es unmöglich ist, einzelne Punkte im Objektivfeld aufzulösen, die sogenannte Beugungsgrenze . Unter der Annahme, dass optische Aberrationen im gesamten optischen Aufbau vernachlässigbar sind, kann die Auflösung d wie folgt angegeben werden:

Üblicherweise wird eine Wellenlänge von 550 nm angenommen, was grünem Licht entspricht. Bei Luft als externem Medium beträgt die höchste praxistaugliche NA 0,95, bei Öl bis zu 1,5. In der Praxis beträgt der niedrigste Wert von d , der mit herkömmlichen Linsen erhältlich ist, etwa 200 nm. Ein neuartiger Linsentyp mit mehrfacher Lichtstreuung ermöglichte es, die Auflösung auf unter 100 nm zu verbessern.

Überschreiten der Auflösungsgrenze

Es stehen mehrere Techniken zur Verfügung, um Auflösungen zu erreichen, die höher als die oben beschriebene Durchlichtgrenze sind. Auch holographische Techniken, wie sie 1979 von Courjon und Bulabois beschrieben wurden, sind in der Lage, diese Auflösungsgrenze zu durchbrechen, obwohl die Auflösung in ihrer experimentellen Analyse eingeschränkt war.

Unter Verwendung fluoreszierender Proben stehen weitere Techniken zur Verfügung. Beispiele umfassen Vertico SMI , optische Nahfeld-Scanning-Mikroskopie, die evaneszente Wellen verwendet , und stimulierte Emissionsverarmung . Im Jahr 2005 wurde ein Mikroskop, das ein einzelnes Molekül erkennen kann, als Lehrmittel beschrieben.

Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten zehn Jahren bleiben Techniken zum Überschreiten der Beugungsgrenze begrenzt und spezialisiert.

Während sich die meisten Techniken auf die Erhöhung der lateralen Auflösung konzentrieren, gibt es auch einige Techniken, die darauf abzielen, die Analyse extrem dünner Proben zu ermöglichen. Zum Beispiel sarfus platzieren Verfahren die dünne Probe auf einer kontrastverstärkenden Oberfläche und ermöglicht es dadurch , um direkt Filme so dünn wie 0,3 Nanometer zu visualisieren.

Am 8. Oktober 2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an Eric Betzig , William Moerner und Stefan Hell für die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie verliehen .

Strukturierte Beleuchtung SMI

SMI (Spatial Modulated Illumination Microscopy) ist ein lichtoptisches Verfahren der sogenannten Point Spread Function (PSF) Technik. Dabei handelt es sich um Verfahren, die die PSF eines Mikroskops in geeigneter Weise modifizieren , um entweder die optische Auflösung zu erhöhen, die Genauigkeit von Entfernungsmessungen von fluoreszierenden Objekten, die relativ zur Wellenlänge des Beleuchtungslichts klein sind , zu maximieren oder andere Strukturparameter in . zu extrahieren im Nanometerbereich.

Lokalisierungsmikroskopie SPDMphymod

3D Dual Color Super Resolution Mikroskopie Cremer ab 2010
3D Dual Color Super Resolution Mikroskopie mit Her2 und Her3 in Brustzellen, Standardfarbstoffe: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy), die Basistechnologie der Lokalisationsmikroskopie, ist ein lichtoptisches Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, das Positions-, Abstands- und Winkelmessungen an "optisch isolierten" Partikeln (zB Molekülen) weit unterhalb der theoretischen Auflösungsgrenze für die Lichtmikroskopie ermöglicht. „Optisch isoliert“ bedeutet, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt nur ein einzelnes Partikel/Molekül innerhalb eines durch konventionelle optische Auflösung bestimmten Größenbereichs (typischerweise ca. 200–250 nm Durchmesser ) registriert wird. Dies ist möglich, wenn Moleküle innerhalb einer solchen Region alle unterschiedliche spektrale Marker tragen (zB unterschiedliche Farben oder andere nutzbare Unterschiede in der Lichtemission verschiedener Partikel).

Viele Standard-Fluoreszenzfarbstoffe wie GFP , Alexa-Farbstoffe, Atto-Farbstoffe, Cy2/Cy3- und Fluorescein-Moleküle können für die Lokalisationsmikroskopie verwendet werden, sofern bestimmte photophysikalische Bedingungen vorliegen. Bei dieser sogenannten SPDMphymod-Technologie (Physical Modifizierbare Fluorophore) reicht eine einzige Laserwellenlänge geeigneter Intensität für die Nanoabbildung aus.

3D Super Resolution Mikroskopie

3D Super Resolution Mikroskopie mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen kann durch Kombination von Lokalisierungsmikroskopie für Standard-Fluoreszenzfarbstoffe SPDMphymod und strukturierter Beleuchtung SMI erreicht werden.

STED

Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopiebild von Aktinfilamenten innerhalb einer Zelle.

Die stimulierte Emissionsverarmung ist ein einfaches Beispiel dafür, wie eine höhere Auflösung möglich ist, die die Beugungsgrenze überschreitet, aber sie hat große Einschränkungen. STED ist eine Fluoreszenzmikroskopietechnik, die eine Kombination von Lichtimpulsen verwendet, um Fluoreszenz in einer kleinen Unterpopulation fluoreszierender Moleküle in einer Probe zu induzieren. Jedes Molekül erzeugt einen beugungsbegrenzten Lichtfleck im Bild, und die Mitte jedes dieser Flecken entspricht der Position des Moleküls. Da die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle gering ist, ist es unwahrscheinlich, dass sich die Lichtflecke überlappen und können daher genau platziert werden. Dieser Vorgang wird dann viele Male wiederholt, um das Bild zu erzeugen. Stefan Hell vom Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie wurde 2006 mit dem 10. Deutschen Zukunftspreis und 2014 mit dem Nobelpreis für Chemie für seine Entwicklung des STED-Mikroskops und zugehöriger Methoden ausgezeichnet.

Alternativen

Um die durch die Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts gesetzten Beschränkungen zu überwinden, wurden andere Mikroskope entwickelt, die andere Wellen verwenden.

Es ist wichtig zu beachten, dass höherfrequente Wellen eine begrenzte Wechselwirkung mit Materie haben, zum Beispiel sind Weichteile relativ transparent für Röntgenstrahlen, was zu unterschiedlichen Kontrastquellen und unterschiedlichen Zielanwendungen führt.

Die Verwendung von Elektronen und Röntgenstrahlen anstelle von Licht ermöglicht eine viel höhere Auflösung – die Wellenlänge der Strahlung ist kürzer, so dass die Beugungsgrenze niedriger ist. Um die Kurzwellensonde zerstörungsfrei zu machen, wurde das Atomstrahlabbildungssystem ( atomares Nanoskop ) vorgeschlagen und in der Literatur ausführlich diskutiert, aber es ist noch nicht mit herkömmlichen Abbildungssystemen konkurrenzfähig.

STM und AFM sind Rastersondentechniken, bei denen eine kleine Sonde verwendet wird, die über die Probenoberfläche gescannt wird. Die Auflösung ist in diesen Fällen durch die Größe der Sonde begrenzt; Mikrobearbeitungstechniken können Sonden mit Spitzenradien von 5–10 nm herstellen.

Darüber hinaus verwenden Methoden wie die Elektronen- oder Röntgenmikroskopie ein Vakuum oder Teilvakuum, was ihre Verwendung für lebende und biologische Proben (mit Ausnahme eines Umgebungsrasterelektronenmikroskops ) einschränkt . Die für all diese Instrumente benötigten Probenkammern schränken auch die Probengröße ein und die Probenmanipulation ist schwieriger. In Bildern, die mit diesen Methoden erstellt wurden, ist keine Farbe zu sehen, sodass einige Informationen verloren gehen. Sie sind jedoch wesentlich , wenn molekulare oder atomare Auswirkungen zu untersuchen, wie Alterungshärten in Aluminiumlegierungen , oder die Mikrostruktur von Polymeren .

Siehe auch

Verweise

Zitierte Quellen

  • Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Die Ursprünge des Teleskops . Universitätspresse Amsterdam. ISBN 978-9069846156.

Weiterlesen

  • "Metallographic and Materialographic Specimen Preparation, Light Microscopy, Image Analysis and Hardness Testing", Kay Geels in Zusammenarbeit mit Struers A/S, ASTM International 2006.
  • "Lichtmikroskopie: Eine laufende zeitgenössische Revolution" , Siegfried Weisenburger und Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.

Externe Links