Serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie - Serial block-face scanning electron microscopy
Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie ist eine Methode, um hochauflösende dreidimensionale Bilder von kleinen Proben zu erzeugen. Die Technik wurde für Hirngewebe entwickelt, ist aber für alle biologischen Proben weit verbreitet. Ein serielles Rasterelektronenmikroskop mit Blockfläche besteht aus einem Ultramikrotom, das in der Vakuumkammer eines Rasterelektronenmikroskops montiert ist . Proben werden durch Verfahren ähnlich denen der Transmissionselektronenmikroskopie ( TEM ) hergestellt, typischerweise durch Fixieren der Probe mit Aldehyd, Anfärben mit Schwermetallen wie Osmium und Uran und dann Einbetten in ein Epoxidharz. Die Oberfläche des Blocks der in Harz eingebetteten Probe wird durch Detektion rückgestreuter Elektronen abgebildet. Nach der Bildgebung wird das Ultramikrotom verwendet, um einen dünnen Schnitt (typischerweise etwa 30 nm) von der Vorderseite des Blocks zu schneiden. Nachdem der Schnitt geschnitten wurde, wird der Probenblock wieder in die Fokusebene angehoben und erneut abgebildet. Diese Sequenz von Probenaufnahme, Schnitt und Blockerhöhung kann viele tausend Bilder in perfekter Ausrichtung automatisiert aufnehmen. Die praktische serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie wurde 2004 von Winfried Denk am Max-Planck-Institut in Heidelberg erfunden und ist im Handel von Gatan Inc., Thermo Fisher Scientific (VolumeScope) und ConnectomX erhältlich.
Anwendungen
Eine der ersten Anwendungen der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie war die Analyse der Konnektivität von Axonen im Gehirn. Die Auflösung reicht aus, um selbst dünnste Axone aufzuspüren und Synapsen zu identifizieren. Inzwischen hat die serielle Blockgesichtsbildgebung zu vielen Bereichen beigetragen, wie Entwicklungsbiologie, Pflanzenbiologie, Krebsforschung, Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen usw. Die Technik kann extrem große Datensätze generieren und Algorithmen zur automatischen Segmentierung der sehr großen Daten entwickeln generierten Sets ist immer noch eine Herausforderung. In diesem Bereich wird derzeit jedoch viel gearbeitet. Das EyeWire- Projekt nutzt menschliche Berechnungen in einem Spiel , um Neuronen durch Bilder eines Netzhautvolumens zu verfolgen, die mit serieller Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie aufgenommen wurden.
Viele verschiedene Proben können für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet werden und das Ultramikrotom kann viele Materialien schneiden, daher hat diese Technik eine breitere Anwendbarkeit. Es beginnt, Anwendungen in vielen anderen Bereichen zu finden, die von der Zell- und Entwicklungsbiologie bis hin zu den Materialwissenschaften reichen.
Vorteile und Nachteile
Nachteilig bei der SBEM-Methode ist, dass die Dicke der Schicht, die mit dem Ultramikrotom abgetragen werden kann, begrenzt ist (~25 nm) und somit die Auflösung in Tiefenrichtung begrenzt ist. Ein Vorteil der SBEM-Technik besteht darin, dass die Probe stationär ist, was die Ausrichtung in den Bildstapeln verbessert. Ein weiterer Vorteil der SBEM-Technik ist die Möglichkeit, große Datensätze mit einem hohen Detaillierungsgrad zu erfassen. Da das Schneiden durch das Ultramikrotom extrem schnell ist (im Vergleich zum Fräsprozess im FIB-REM), kann es bei jedem Schnitt einen großen Bereich des Materials (x- und y-Richtung) freilegen. Außerdem können wir durch schnelles Schneiden in kurzer Zeit viele Bilder in z-Richtung aufnehmen.