STED-Mikroskopie - STED microscopy

Die Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie bietet signifikante Auflösungsverbesserungen gegenüber denen, die mit der konfokalen Mikroskopie möglich sind .

Die Stimulated Emission Depletion ( STED ) -Mikroskopie ist eine der Techniken, die die superauflösende Mikroskopie ausmachen . Es erzeugt hochauflösende Bilder durch die selektive Deaktivierung von Fluorophoren , minimiert die Beleuchtungsfläche im Brennpunkt und verbessert so die erreichbare Auflösung für ein gegebenes System. Es wurde 1994 von Stefan W. Hell und Jan Wichmann entwickelt und 1999 von Hell und Thomas Klar erstmals experimentell demonstriert. Für seine Entwicklung erhielt Hell 2014 den Nobelpreis für Chemie . 1986 hatte VA Okhonin (Institut für Biophysik, Akademie der Wissenschaften der UdSSR, Sibirischer Zweig, Krasnojarsk) die STED-Idee patentieren lassen. Dieses Patent war Hell und Wichmann 1994 vielleicht unbekannt.

STED-Mikroskopie ist eine von mehreren Arten von superauflösenden Mikroskopietechniken , die kürzlich entwickelt wurden, um die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und die Auflösung zu erhöhen. STED ist eine deterministische Funktionstechnik, die die nichtlineare Reaktion von Fluorophoren ausnutzt, die üblicherweise zur Markierung biologischer Proben verwendet werden, um eine Verbesserung der Auflösung zu erreichen, d. h. STED ermöglicht die Aufnahme von Bildern mit Auflösungen unterhalb der Beugungsgrenze. Dies unterscheidet sich von den stochastischen Funktionstechniken wie der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) und der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), da diese Methoden mathematische Modelle verwenden, um eine Subbeugungsgrenze aus vielen Sätzen beugungsbegrenzter Bilder zu rekonstruieren.

Hintergrund

Ernst Abbes Formel für die Beugungsgrenze, in Stein gemeißelt an einem Denkmal in Jena .
Jablonski-Diagramm, das die Rotverschiebung des stimulierten Photons zeigt. Diese Rotverschiebung erlaubt es, das stimulierte Photon zu ignorieren.
Diagramm des Designs eines STED-Geräts. Das Doppellaserdesign ermöglicht die gemeinsame Verwendung von Anregung und stimulierter Emission für STED.

In der herkömmlichen Mikroskopie ist die erreichbare Auflösung durch die Beugung des Lichts begrenzt . Ernst Abbe hat eine Gleichung entwickelt, um diese Grenze zu beschreiben. Die Gleichung lautet:

wobei D die Beugungsgrenze ist, λ die Wellenlänge des Lichts ist und NA die numerische Apertur oder der Brechungsindex des Mediums multipliziert mit dem Sinus des Einfallswinkels ist. n beschreibt den Brechungsindex der Probe, α misst den festen Halbwinkel, aus dem Licht von einem Objektiv aufgenommen wird, λ ist die Wellenlänge des Lichts, mit der die Probe angeregt wird, und NA ist die numerische Apertur. Um eine hohe Auflösung (dh kleine d-Werte) zu erhalten, sind kurze Wellenlängen und hohe NA-Werte (NA = n sinα) optimal. Diese Beugungsgrenze ist der Standard, nach dem alle Superauflösungsverfahren gemessen werden. Da STED die Fluoreszenz selektiv deaktiviert, kann es eine bessere Auflösung erreichen als die herkömmliche konfokale Mikroskopie. Normale Fluoreszenz tritt auf, indem ein Elektron aus dem Grundzustand in einen angeregten elektronischen Zustand eines anderen fundamentalen Energieniveaus (S0 geht zu S1) angeregt wird, das nach der Entspannung in den Grundzustand (von S1) ein Photon emittiert, indem es von S1 auf . fällt ein Schwingungsenergieniveau auf S0. STED unterbricht diesen Vorgang, bevor das Photon freigesetzt wird. Das angeregte Elektron wird gezwungen, in einen höheren Schwingungszustand zu relaxieren, als der Fluoreszenzübergang eintreten würde, wodurch das freigesetzte Photon rotverschoben wird, wie im Bild rechts gezeigt. Da das Elektron in einen höheren Schwingungszustand übergeht, ist die Energiedifferenz der beiden Zustände geringer als die normale Fluoreszenzdifferenz. Diese Energieabsenkung erhöht die Wellenlänge und bewirkt, dass das Photon weiter in das rote Ende des Spektrums verschoben wird. Diese Verschiebung unterscheidet die beiden Arten von Photonen und ermöglicht, dass das stimulierte Photon ignoriert wird.

Um diese alternative Emission zu erzwingen, muss ein einfallendes Photon auf das Fluorophor treffen. Diese Notwendigkeit, von einem einfallenden Photon getroffen zu werden, hat zwei Auswirkungen auf STED. Erstens beeinflusst die Anzahl der einfallenden Photonen direkt die Effizienz dieser Emission, und zweitens kann bei ausreichend großen Photonenzahlen die Fluoreszenz vollständig unterdrückt werden. Um die große Anzahl einfallender Photonen zu erreichen, die zur Unterdrückung der Fluoreszenz erforderlich ist, muss der zur Erzeugung der Photonen verwendete Laser eine hohe Intensität aufweisen. Leider kann dieser hochintensive Laser zu dem Problem des Photobleichens des Fluorophors führen. Photobleaching ist die Bezeichnung für die Zerstörung von Fluorophoren durch hochintensives Licht.

Verfahren

Vergleich von konfokaler Mikroskopie und STED-Mikroskopie. Dies zeigt die verbesserte Auflösung der STED-Mikroskopie gegenüber herkömmlichen Techniken.
Anregungsfleck (2D, links), Donut-förmiger Entregungsfleck (Mitte) und verbleibender fluoreszierender Bereich (rechts).

STED funktioniert durch Abreichern der Fluoreszenz in bestimmten Regionen der Probe, während ein zentraler Brennfleck aktiv bleibt, um Fluoreszenz zu emittieren. Dieser Fokusbereich kann konstruiert werden, indem die Eigenschaften der Pupillenebene der Objektivlinse geändert werden. Das gebräuchlichste frühe Beispiel dieser diffraktiven optischen Elemente oder DOEs ist eine Torusform , die in der unten gezeigten zweidimensionalen seitlichen Begrenzung verwendet wird. Die rote Zone ist aufgebraucht, während der grüne Fleck aktiv gelassen wird. Dieses DOE wird durch eine zirkulare Polarisation des Verarmungslasers in Kombination mit einem optischen Wirbel erzeugt . Die laterale Auflösung dieses DOE liegt typischerweise zwischen 30 und 80 nm. Es wurden jedoch Werte bis hinunter zu 2,4 nm berichtet. Unter Verwendung verschiedener DOEs wurde eine axiale Auflösung in der Größenordnung von 100 nm demonstriert. Eine modifizierte Abbe-Gleichung beschreibt diese Subbeugungsauflösung als:

Wo ist der Brechungsindex des Mediums, ist die Intrakavitätsintensität und ist die Sättigungsintensität . Wo ist der Sättigungsfaktor, der das Verhältnis der angewendeten (maximalen) STED-Intensität zur Sättigungsintensität ausdrückt, .

Um die Effektivität von STED zu optimieren, muss die destruktive Interferenz im Zentrum des Brennflecks so gut wie möglich perfekt sein. Das erlegt den verwendbaren Optiken gewisse Einschränkungen auf.

Farbstoffe

Zu Beginn der Entwicklung von STED war die Zahl der Farbstoffe, die in dem Verfahren verwendet werden konnten, sehr begrenzt. Rhodamin B wurde in der ersten theoretischen Beschreibung von STED genannt. Als Ergebnis wurden die ersten verwendeten Farbstoffe im roten Spektrum laseremittiert. Um eine STED-Analyse biologischer Systeme zu ermöglichen, müssen die Farbstoffe und Laserquellen auf das System zugeschnitten sein. Dieser Wunsch nach einer besseren Analyse dieser Systeme hat zu Lebendzell-STED und Mehrfarben-STED geführt, aber es erforderte auch immer fortschrittlichere Farbstoffe und Anregungssysteme, um der erhöhten Funktionalität gerecht zu werden.

Ein solcher Fortschritt war die Entwicklung immunmarkierter Zellen. Diese Zellen sind STED-Fluoreszenzfarbstoffe, die über Amidbindungen an Antikörper gebunden sind. Die erste Anwendung dieser Technik koppelte MR-121SE, einen roten Farbstoff, mit einem sekundären Anti-Maus-Antikörper. Seit dieser ersten Anwendung wurde diese Technik auf einen viel breiteren Bereich von Farbstoffen angewendet, einschließlich grün emittierender Atto 532 und gelb emittierender Atto 590 sowie zusätzlicher rot emittierender Farbstoffe. Darüber hinaus wurde Atto 647N erstmals mit dieser Methode verwendet, um zweifarbige STED herzustellen.

Anwendungen

STED hat sich in den letzten Jahren von einer komplexen und hochspezifischen Technik zu einer allgemeinen Fluoreszenzmethode entwickelt. Als Ergebnis wurden eine Reihe von Methoden entwickelt, um den Nutzen von STED zu erweitern und mehr Informationen bereitzustellen.

Strukturanalyse

Von Beginn des Prozesses an hat STED der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht, Aufgaben zu erfüllen, die bisher nur mit Elektronenmikroskopie möglich waren. Als Beispiel wurde STED zur Aufklärung der Proteinstrukturanalyse auf Suborganellenebene verwendet. Der gemeinsame Beweis für dieses Studienniveau ist die Beobachtung von Zytoskelettfilamenten. Darüber hinaus werden Neurofilamente , Aktin und Tubulin häufig verwendet, um das Auflösungsvermögen von STED- und konfokalen Mikroskopen zu vergleichen.

Mit STED wurde bei der Untersuchung von SNAP25 , einem menschlichen Protein, das die Membranfusion reguliert , eine laterale Auflösung von 70 – 90 nm erreicht . Diese Beobachtung hat gezeigt, dass SNAP25 unabhängig von der Funktionalität des SNARE-Motivs Cluster bildet und an geclustertes Syntaxin bindet. Auch Untersuchungen an komplexen Organellen wie Mitochondrien profitieren von der STED-Mikroskopie zur Strukturanalyse. Unter Verwendung speziell angefertigter STED-Mikroskope mit einer lateralen Auflösung von weniger als 50 nm verteilten sich die mitochondrialen Proteine Tom20 , VDAC1 und COX2 als nanoskalige Cluster. Eine andere Studie verwendete eine hausgemachte STED-Mikroskopie und einen DNA- bindenden Fluoreszenzfarbstoff, der die Länge von DNA-Fragmenten viel genauer maß als herkömmliche Messungen mit konfokaler Mikroskopie .

Korrelative Methoden

Aufgrund ihrer Funktion kann die STED-Mikroskopie oft mit anderen hochauflösenden Methoden verwendet werden. Die Auflösung sowohl der Elektronen- als auch der Rasterkraftmikroskopie ist sogar besser als die STED-Auflösung, aber durch die Kombination von Rasterkraft mit STED haben Shima et al. konnten das Aktin-Zytoskelett von menschlichen Eierstockkrebszellen visualisieren und gleichzeitig Veränderungen der Zellsteifigkeit beobachten.

Mehrfarbig

Multicolor STED wurde als Reaktion auf ein wachsendes Problem bei der Verwendung von STED zur Untersuchung der Abhängigkeit zwischen Struktur und Funktion in Proteinen entwickelt. Um diese Art von komplexem System zu untersuchen, müssen mindestens zwei separate Fluorophore verwendet werden. Mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Strahlpaaren ist eine kolokalisierte Bildgebung von synaptischen und mitochondrialen Proteinclustern mit einer Auflösung von bis zu 5 nm möglich [18]. Multicolor STED wurde auch verwendet, um zu zeigen, dass verschiedene Populationen von synaptischen Vesikelproteinen sich nicht aus synaptischen Escape-Boutons mischen. Durch die Verwendung von Zweifarben-STED mit Multi-Lifetime-Bildgebung ist Dreikanal-STED möglich.

Live-Zelle

Schon früh wurde STED als nützliche Technik für die Arbeit mit lebenden Zellen angesehen. Leider war die einzige Möglichkeit, Zellen zu untersuchen, die Plasmamembran mit organischen Farbstoffen zu markieren. Die Kombination von STED mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zeigte, dass Cholesterin- vermittelte Molekülkomplexe Sphingolipide einfangen , jedoch nur vorübergehend. Allerdings bieten nur fluoreszierende Proteine ​​die Möglichkeit, Organellen oder Proteine ​​in einer lebenden Zelle sichtbar zu machen. Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren bei einer lateralen Auflösung von 50 nm in Citrin-Tubulin-exprimierenden Säugerzellen funktioniert. Neben dem Nachweis von Strukturen in Säugerzellen hat STED die Visualisierung von Clustern von YFP-markierten PIN-Proteinen in der Plasmamembran von Pflanzenzellen ermöglicht.

Kürzlich wurde mehrfarbige Lebendzell-STED unter Verwendung eines gepulsten dunkelroten Lasers und CLIPf-Tag- und SNAPf-Tag-Expression durchgeführt.

Im Gehirn intakter Tiere

Oberflächliche Schichten des Mauskortex können wiederholt durch ein kraniales Fenster abgebildet werden. Dies ermöglicht es, das Schicksal und die Form einzelner dendritischer Dornen über viele Wochen zu verfolgen. Mit zweifarbiger STED ist es sogar möglich, die Nanostruktur der postsynaptischen Dichte bei lebenden Tieren aufzulösen .

STED bei Videoraten und darüber hinaus

Superauflösung erfordert kleine Pixel, was bedeutet, dass mehr Räume in einer bestimmten Probe erfasst werden müssen, was zu einer längeren Erfassungszeit führt. Die Brennfleckgröße hängt jedoch von der Intensität des Lasers ab, der zur Verarmung verwendet wird. Als Ergebnis kann diese Punktgröße abgestimmt werden, wodurch die Größe und die Abbildungsgeschwindigkeit geändert werden. Zwischen diesen beiden Faktoren kann dann für jede spezifische Bildgebungsaufgabe ein Kompromiss gefunden werden. Es wurden Geschwindigkeiten von 80 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet, mit Brennflecken um 60 nm. Bei kleinen Sichtfeldern werden bis zu 200 Bilder pro Sekunde erreicht.

Probleme

Photobleaching kann entweder durch Anregung in einen noch höheren angeregten Zustand oder durch Anregung im Triplettzustand erfolgen. Um die Anregung eines angeregten Elektrons in einen anderen, höher angeregten Zustand zu verhindern, sollte die Energie des Photons, die zum Auslösen der alternativen Emission benötigt wird, die Energie der Anregung von einem angeregten Zustand zum anderen nicht überlappen. Dadurch wird sichergestellt, dass jedes Laserphoton, das mit den Fluorophoren in Kontakt kommt, eine stimulierte Emission verursacht und nicht dazu führt, dass das Elektron in einen anderen, höheren Energiezustand angeregt wird. Triplettzustände haben eine viel längere Lebensdauer als Singulettzustände, und um eine Anregung von Triplettzuständen zu verhindern, muss die Zeit zwischen den Laserpulsen lang genug sein, damit das Elektron durch eine andere Löschmethode relaxieren kann, oder es sollte eine chemische Verbindung hinzugefügt werden, um das Triplett zu löschen Zustand.

Siehe auch

Verweise

Externe Links