In-vitro- Toxikologie - In vitro toxicology
In - vitro - Toxizitätstests ist die wissenschaftliche Analyse der Wirkungen von toxischen chemischen Substanzen auf gezüchteten Bakterien oder Säugerzellen . In vitro (wörtlich ‚im Glas‘) werden Testverfahren eingesetzt erster Linie potentiell gefährliche Chemikalien zu identifizieren und / oder den Mangel an bestimmten toxischen Eigenschaften in den frühen Phasen der Entwicklung von potentiell nützlichen neuen Substanzen wie therapeutische zu bestätigen Medikamente , landwirtschaftliche Chemikalien und Lebensmittelzusatzstoffe.
In-vitro- Tests auf xenobiotische Toxizität werden kürzlich von wichtigen Regierungsbehörden (z. B. EPA; NIEHS / NTP; FDA) sorgfältig geprüft, um die Risiken für den Menschen besser einschätzen zu können. Die Verwendung von In-vitro-Systemen zur Verbesserung des mechanistischen Verständnisses toxischer Aktivitäten und die Verwendung menschlicher Zellen und Gewebe zur Definition menschenspezifischer toxischer Wirkungen sind mit erheblichen Aktivitäten verbunden.
Verbesserung gegenüber Tierversuchen
Die meisten Toxikologen glauben, dass In-vitro- Toxizitätstestmethoden nützlicher, zeit- und kostengünstiger sein können als Toxikologiestudien an lebenden Tieren (die als In-vivo- Methoden oder "In-Life" -Methoden bezeichnet werden). Die Extrapolation von in vitro nach in vivo erfordert jedoch einige sorgfältige Überlegungen und ist ein aktives Forschungsgebiet.
Aufgrund regulatorischer Einschränkungen und ethischer Überlegungen hat die Suche nach Alternativen zu Tierversuchen eine neue Dynamik erhalten. In vielen Fällen sind die In-vitro-Tests besser als Tierversuche, da sie zur Entwicklung sicherer Produkte verwendet werden können.
Die United States Environmental Protection Agency studierte 1065 Chemie- und Arzneimittelsubstanzen in ihrem ToxCast Programm (Teil des CompTox Chemicals Armaturenbrett ) unter Verwendung von in Silica - Modellierung und ein humanen pluripotenten Stammzellen- basierten Test zur Vorhersage in vivo Entwicklungsrauschmitteln auf Basis von Veränderungen im zellulären Stoffwechsel folgenden Chemikalienexposition. Zu den wichtigsten Ergebnissen der Analyse dieses im Jahr 2020 veröffentlichten ToxCast_STM-Datensatzes gehören: (1) 19% von 1065 Chemikalien ergaben eine Vorhersage der Entwicklungstoxizität , (2) die Testleistung erreichte eine Genauigkeit von 79% bis 82% mit hoher Spezifität (> 84%), aber bescheidene Sensitivität (<67%) im Vergleich zu In-vivo- Tiermodellen der pränatalen Entwicklungstoxizität beim Menschen, (3) Verbesserung der Sensitivität, da strengere Beweiskraftanforderungen an die Tierstudien angewendet wurden, und (4) statistische Analyse der wirksamsten Chemikalie Treffer auf bestimmte biochemische Ziele in ToxCast zeigten positive und negative Assoziationen mit der STM-Reaktion und lieferten Einblicke in die mechanistischen Grundlagen des Zielendpunkts und seiner biologischen Domäne.
Beispielhafte Zelllebensfähigkeitstests (Zytotoxizitätstests), die für die In-vitro- Toxikologie verwendet werden
Viele Analyseverfahren gibt es für Assay Testsubstanzen auf Cytotoxizität und andere zelluläre Reaktionen.
MTT
Der MTT-Assay wird häufig zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen verwendet und wurde für die Verwendung durch internationale Organisationen validiert. Der MTT-Assay umfasst zwei Schritte, bei denen der Assay in die Chemikalien eingeführt wird, und anschließend einen Solubilisierungsschritt.
MTS
Der kolorimetrische In-vitro-Test MTS (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2Htetrazolium) ist eine aktualisierte Version des validierten MTT-Verfahrens MTS Assay hat den Vorteil, löslich zu sein. Daher ist kein Solubilisierungsschritt erforderlich.
ATP
Der ATP- Assay hat den Hauptvorteil, dass er schnell (innerhalb von 15 Minuten) Ergebnisse liefert und nur weniger Probenzellen benötigt. Der Assay führt eine Lyse an den Zellen durch und die folgende chemische Reaktion zwischen dem Assay und dem ATP-Gehalt der Zellen erzeugt Lumineszenz. Die Lumineszenzmenge wird dann mit einem Photometer gemessen und kann in seitdem lebende Zahlenzellen übersetzt werden
- Der ATP-Assay geht davon aus, dass lebende Zellen noch ATP enthalten
- Das aufgezeichnete Lumineszenzniveau ist proportional zum ATP-Gehalt in den Probenzellen.
Neutralrot
Ein weiterer Endpunkt für die Lebensfähigkeit der Zellen kann die Aufnahme von Neutralrot (NR) sein. Neutralrot, ein schwacher kationischer Farbstoff, dringt durch Nichtdiffusion in Zellmembranen ein und reichert sich interzellulär in Lysosomen an. Lebensfähige Zellen nehmen den NR-Farbstoff auf, beschädigte oder tote Zellen nicht.
Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)
ELISA- Kits können verwendet werden, um die Auf- und Abregulation von proinflammatorischen Mediatoren wie Zytokinen (IL-1, TNF alpha, PGE2) zu untersuchen.
Die Messung dieser Arten von Zellreaktionen kann ein Fenster in die Interaktion des Testartikels mit den Testmodellen (Monolayer-Zellkulturen, 3D-Gewebemodelle, Gewebeexplantate) sein.
Arten von In-vitro- Studien
Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Arten von In-vitro- Studien, abhängig von dem für die Durchführung des Experiments entwickelten Typsystem. Die zwei Arten von Systemen, die allgemein verwendet werden, sind: a) Statisches Bohrlochplattensystem und b) Mehrkompartiment-Perfusionssysteme.
Statisches Bohrlochplattensystem
Die statischen Well-Platten- oder Schichtsysteme sind die traditionellste und einfachste Form von Assays, die häufig für In-vitro-Untersuchungen verwendet werden. Diese Assays sind sehr vorteilhaft, da sie recht einfach sind und eine sehr zugängliche Testumgebung für die Überwachung von Chemikalien sowohl im Kulturmedium als auch in der Zelle bieten. Der Nachteil der Verwendung dieser einfachen statischen Well-Plate-Assays besteht jedoch darin, dass sie die zellulären Wechselwirkungen und physiologischen Flüssigkeitsströmungsbedingungen, die im Körper stattfinden, nicht darstellen können.
Perfundierte Systeme mit mehreren Kompartimenten
Es werden jetzt neue Testplattformen entwickelt, um Probleme im Zusammenhang mit zellulären Interaktionen zu lösen. Diese neuen Plattformen sind viel komplexer und basieren auf perfundierten Systemen mit mehreren Kompartimenten. Das Hauptziel dieser Systeme besteht darin, In-vivo-Mechanismen zuverlässiger zu reproduzieren, indem eine Zellkulturumgebung bereitgestellt wird, die der In-vivo-Situation nahe kommt. Jedes Kompartiment im System repräsentiert ein spezifisches Organ des lebenden Organismus und somit hat jedes Kompartiment spezifische Eigenschaften und Kriterien. Jedes Kompartiment in diesen Systemen ist durch Schläuche und Pumpen verbunden, durch die die Flüssigkeit fließt, wodurch der Blutfluss in der In-vivo-Situation nachgeahmt wird. Der Nachteil bei der Verwendung dieser perfundierten Systeme besteht darin, dass die nachteiligen Auswirkungen (Einfluss sowohl der biologischen als auch der nichtbiologischen Komponenten des Systems auf das Schicksal der untersuchten Chemikalie) im Vergleich zu den statischen Systemen größer sind. Um die Wirkung nichtbiologischer Komponenten des Systems zu verringern, bestehen alle Fächer aus Glas und die Verbindungsrohre aus Teflon. Eine Reihe von kinetischen Modellen wurde vorgeschlagen, um diese unspezifischen Bindungen zu behandeln, die in diesen In-vitro-Systemen stattfinden.
Um die biologischen Schwierigkeiten zu verbessern, die sich aus der Verwendung verschiedener Kulturbedingungen in vitro ergeben, müssen die traditionellen Modelle, die in Kolben oder Mikrotiterplatten verwendet werden, modifiziert werden. Mit der parallelen Entwicklung von Mikrotechnologien und Tissue Engineering werden diese Probleme mithilfe neuer einschlägiger Werkzeuge gelöst, die als "mikrofluidische Biochips" bezeichnet werden.