Intrinsische Terminierung - Intrinsic termination
Die intrinsische oder rho-unabhängige Termination ist ein Prozess in Prokaryonten , der das Ende der Transkription signalisiert und das neu konstruierte RNA- Molekül freisetzt . In Prokaryoten wie E. coli wird die Transkription entweder durch einen Rho-abhängigen Prozess oder einen Rho-unabhängigen Prozess beendet. Bei dem Rho-abhängigen Prozess lokalisiert und bindet das Rho-Protein die Signalsequenz in der mRNA und signalisiert die Spaltung. Im Gegensatz dazu erfordert die intrinsische Termination kein spezielles Protein, um die Termination zu signalisieren und wird durch die spezifischen Sequenzen der RNA kontrolliert. Wenn der Terminationsprozess beginnt, bildet die transkribierte mRNA eine stabile Sekundärstruktur-Haarnadelschleife, auch bekannt als aStamm-Schleife . Dieser RNA-Haarnadel folgen mehrere Uracil-Nukleotide. Die Bindungen zwischen Uracil und Adenin sind sehr schwach. Ein an RNA-Polymerase (nusA) gebundenes Protein bindet sich fest genug an die Stamm-Schleife-Struktur, um die Polymerase vorübergehend zum Stillstand zu bringen. Dieses Pausieren der Polymerase fällt mit der Transkription der Poly-Uracil-Sequenz zusammen. Die schwachen Adenin-Uracil-Bindungen senken die Destabilisierungsenergie für den RNA-DNA-Duplex, wodurch er sich abwickeln und von der RNA-Polymerase dissoziieren kann. Insgesamt ist die modifizierte RNA-Struktur das, was die Transkription beendet.
Stamm-Schleifen-Strukturen, denen keine Poly-Uracil-Sequenz folgt, bewirken, dass die RNA-Polymerase anhält, aber typischerweise wird die Transkription nach kurzer Zeit fortgesetzt, da der Duplex zu stabil ist, um sich weit genug abzuwickeln, um eine Termination zu bewirken.
Die Rho-unabhängige Transkriptionstermination ist ein häufiger Mechanismus, der der Aktivität von cis- wirkenden RNA-Regulationselementen, wie z. B. Riboswitches, zugrunde liegt .
Funktion
Die Zweckfunktion der intrinsischen Termination besteht darin, die Dissoziation des ternären Elongationskomplexes (TEC) zu signalisieren, der das Ende eines Transkripts in Prokaryonten signalisiert. Intrinsische Termination unabhängig vom Protein Rho , im Gegensatz zur Rho-abhängigen Termination, bei der das prokaryontische Rho-Protein hereinkommt und auf die RNA-Polymerase einwirkt, wodurch diese dissoziiert wird. Hier gibt es kein zusätzliches Protein und das Transkript bildet eine eigene Schleifenstruktur. Die intrinsische Termination reguliert somit auch das Transkriptionsniveau, bestimmt, wie viele Polymerase ein Gen über einen bestimmten Zeitraum transkribieren können, und kann dazu beitragen, Interaktionen mit benachbarten Chromosomen zu verhindern.
Regulierung der Eigenterminierung
Der Prozess selbst wird sowohl durch positive als auch durch negative Terminationsfaktoren reguliert, in der Regel durch Modifikation der Haarnadelstruktur. Dies wird durch Interaktionen mit einzelsträngiger RNA erreicht, die dem stromaufwärts gelegenen Bereich der Schleife entspricht, was zu einer Unterbrechung des Terminationsprozesses führt. Darüber hinaus gibt es einige Hinweise darauf, dass die Nussstelle auch zur Regulierung beitragen kann, da sie an der Rekrutierung einiger kritischer Komponenten bei der Bildung der Haarnadel beteiligt ist.
Struktur
Bei der intrinsischen Termination verdoppelt sich das RNA-Transkript zurück und bildet Basenpaare mit sich selbst, wodurch eine RNA -Stammschleifen- oder Haarnadelstruktur entsteht. Diese Struktur ist entscheidend für die Freisetzung sowohl des Transkripts als auch der Polymerase am Ende der Transkription. In lebenden Zellen sind die Schlüsselkomponenten die stabile Stammschleife selbst sowie die darauf folgende Sequenz von 6-8 Uracilresten . Der Stamm besteht normalerweise aus 8-9 Basenpaaren, meist Guanin und Cytosin (GC), und die Schleife besteht aus 4-8 Resten. Es wird angenommen, dass der Stammteil der Struktur für die Transkriptionstermination essentiell ist, während die Schleife dies nicht ist. Dies wird durch die Tatsache nahegelegt, dass eine Terminierung in nicht-nativen Strukturen erreicht werden kann, die die Schleife nicht enthalten.
Der Stammteil der Haarnadel ist normalerweise reich an GC-Basenpaaren. GC-Basenpaare haben signifikante Basenstapel-Wechselwirkungen und können drei Wasserstoffbrücken miteinander bilden , was sie thermodynamisch sehr günstig macht. Umgekehrt, während die uracilreiche Sequenz, die der Haarnadelkurve folgt, nicht immer für die Termination notwendig ist, wird angenommen, dass die uracilreiche Sequenz die intrinsische Termination unterstützt, da die UA-Bindung nicht so stark ist wie die GC-Bindung. Diese inhärente Instabilität begünstigt kinetisch die Dissoziation des RNA-Transkripts.
Versuche zur Bestimmung strukturell bedeutsamer Merkmale
Um die optimale Länge des Stiels zu bestimmen, modifizierten die Forscher seine Länge und beobachteten, wie schnell die Beendigung erfolgte. Wenn die Länge des Stammes gegenüber der Standardlänge von 8-9 Basenpaaren verlängert oder verkürzt wurde, war die Termination weniger effizient, und wenn die Änderungen groß genug waren, hörte die Termination vollständig auf.
Experimente haben festgestellt, dass, wenn eine Oligonukleotidsequenz vorhanden ist, die mit dem stromabwärts gelegenen Abschnitt des Stamms identisch ist, sie mit dem stromaufwärts gelegenen Abschnitt Basenpaare bildet. Dies erzeugt eine Struktur, die der nativen Stamm-Schleife-Struktur analog ist, aber die Schleife am Ende fehlt. Ohne das Vorhandensein der Schleife kann eine intrinsische Terminierung immer noch auftreten. Dies zeigt an, dass die Schleife nicht von Natur aus für den intrinsischen Abschluss erforderlich ist.
Im Allgemeinen führt das Fehlen der Uracil-reichen Sequenz nach der Stammschleife zu einer Verzögerung oder Pause in der Transkription, aber die Termination wird nicht vollständig aufhören.
Mechanismus
Die intrinsische Termination wird durch Signale ausgelöst, die direkt in der DNA und RNA kodiert sind. Das Signal erscheint als Haarnadelkurve und wird von 8 Uridinen am 3'-Ende gefolgt. Dies führt zu einer schnellen Dissoziation des Elongationskomplexes. Hairpin inaktiviert und destabilisiert den TEC durch Schwächung der Interaktionen in der RNA-DNA-Bindungsstelle und anderen Stellen, die diesen Komplex zusammenhalten. Die durch die Dehnung von Uracilen induzierte Pause ist wichtig und bietet Zeit für die Bildung von Haarnadeln. In Abwesenheit des U-Trakts führt die Bildung von Haarnadeln nicht zu einer effizienten Beendigung, was auf ihre Bedeutung in diesem Prozess hinweist.
Der Dehnungsdestabilisierungsprozess erfolgt in vier Schritten
1) Da die RNA-Polymerase die letzten Nukleotide des Terminator-U-Trakts transkribiert, pausiert sie am Ende des U-Trakts, wodurch der Terminationsweg in der kinetischen Konkurrenz zwischen Elongation und Termination begünstigt wird
2) Terminator-Haarnadel (Thp) Nukleation
3) Haarnadelvervollständigung und Inaktivierung des Elongationskomplexes
4) Dissoziation des Elongationskomplexes Ein vollständiger Mechanismus beinhaltet wahrscheinlich spezifische Interaktionen der Polymerase, der RNA-Terminator-Haarnadel und dT-reichen Matrizensequenzen.
Hemmung der intrinsischen Terminierung
In Bezug auf Inhibitoren der intrinsischen Termination ist noch vieles unbekannt. Eines der wenigen bekannten Beispiele ist das Bakteriophagenprotein 7. Dieses besteht aus 3,4A und 4,0A Kryo-EM-Strukturen von P7-NusA-TEC und P7-TEC. Dieses Bakteriophagenprotein 7 stoppt die Transkriptionstermination, indem es den RNA-Austrittskanal der RNA-Polymerase (RNAP) blockiert und die RNA-Haarnadelbildung am intrinsischen Terminator verhindert. Darüber hinaus hemmt das Bakteriophagenprotein 7 die RNAP-Klemmbewegungen. Eine Verkürzung der C-terminalen Halbhelix der RNAP verringert die inhibitorische Aktivität geringfügig. Diese RNAP-Klemmbewegungen wurden von einigen anderen Inhibitoren bakterieller RNAP gezielt. Zu diesen Inhibitoren gehören Myxopyronin, Corallopyronin und Ripostatin. Diese wirken, indem sie die Isomerisierung hemmen.
In Prokaryoten: Archaeen vs. Eubakterien
Archaeal Transkription teilt eukaryotische und prokaryotische Verbindungen. Mit Eukaryoten hat es Ähnlichkeiten mit seinen Initiationsfaktoren, die der Transkription helfen, geeignete Sequenzen wie TATA-Box- Homologe zu identifizieren, sowie Faktoren, die die Transkriptionselongation aufrechterhalten. Allerdings werden zusätzliche Transkriptionsfaktoren benötigt, die denen ähnlich sind, die in Prokaryonten gefunden werden, damit der gesamte Prozess ablaufen kann.
Hinsichtlich der Transkriptionstermination ist das Archaeengenom insofern einzigartig, als es sowohl für intrinsische Termination als auch für faktorabhängige Termination empfindlich ist. Bioinformatische Analysen haben gezeigt, dass sich etwa die Hälfte der Gene und Operons in Archaea zu Signalen anordnen oder Signale zur intrinsischen Termination enthalten. Archaeale RNA-Polymerase reagiert sowohl in vivo als auch in vitro auf intrinsische Signale wie die poly-U-reichen Regionen. Im Gegensatz zur typischen prokaryotischen intrinsischen Termination wird jedoch keine spezifische RNA-Struktur oder Haarnadel benötigt. Die Umgebung und andere Genomfaktoren können die Termination noch beeinflussen.
Experimentelle Studien wurden an Thermococcus Kodakarensis durchgeführt , einer Archaea, die in den Thermalquellen und Gasquellen Japans gefunden wurde. Für diese Art wurde ein universeller euryarchaealer Terminationsfaktor namens Eta entdeckt. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Faktor kein Homolog des bakteriellen Terminationsfaktors Rho ist. Wenn Eta auf ein spezifisches Transkript einwirkt, interagiert es mit der RNA-Polymerase sowie mit stromaufwärts gelegenen DNA-Sequenzen auf dem Matrizenstrang. Für die intrinsische Termination bei T. Kodakarensis haben Studien gezeigt, dass neben Haarnadelschleifen auch andere intrinsische Strukturmerkmale zur Termination führen können. Diese Merkmale umfassen die stromaufwärts liegende Anwesenheit einer Oligo-T-Nukleotidsequenz (ungefähr 7-8 T-Nukleotide sind ausreichend) sowie spezifische intergene Terminatorsequenzen mit einem bis drei stromaufwärts gelegenen Oligo-T-Trakten. Während dieser Studien führte das Vorhandensein dieser strukturellen Merkmale zu einer um über 90% reduzierten Expression des Reportergens. Die intergenen Sequenzen wurden mit dem GeSTer-Algorithmus identifiziert, der die Effizienz intrinsischer Terminatoren vorhersagt und ordnet. Weitere Experimente zeigten, dass intergene Sequenzen, die kleine induzierte Mutationen trugen, eine ähnlich reduzierte Expression wie die intergenen Wildtyp-Sequenzen zeigten. Dieser Befund zeigte, dass die reduzierte Expression aufgrund der Termination nicht nur auf den Oligo-T-Trakt oder die mögliche Bildung einer Haarnadel zurückzuführen war.