ANZAHL - NUMT
NUMT , ausgesprochen "neue Macht", ist ein Akronym für " Nu clear m i t ochondrial DNA" -Segment, das vom Evolutionsgenetiker Jose V. Lopez geprägt wurde und eine Transposition jeder Art von zytoplasmatischer mitochondrialer DNA in das Kerngenom eukaryotischer Organismen beschreibt .
Immer mehr NUMT-Sequenzen mit unterschiedlicher Größe und Länge in der unterschiedlichen Anzahl von Eukaryoten wurden entdeckt, da sich mehr Sequenzierungen des gesamten Genoms verschiedener Organismen anhäufen. Tatsächlich wurden NUMTs oft unbeabsichtigt von Forschern entdeckt, die nach mtDNA ( mitochondrialer DNA ) suchten . NUMTs wurden in allen untersuchten Eukaryoten beschrieben, und fast alle mitochondrialen Genomregionen können in das Kerngenom integriert werden. NUMTs unterscheiden sich jedoch in Anzahl und Größe zwischen verschiedenen Arten. Solche Unterschiede können durch interspezifische Variationen in solchen Faktoren wie Keimbahnstabilität und Mitochondrienzahl erklärt werden. Nach der Freigabe der mtDNA zum Zytoplasma aufgrund der mitochondrialen Veränderung und morphologischer Veränderungen, mtDNA in den Kern , der durch eine der verschiedenen vorausgesagten Methoden überführt und schließlich eingeführt werden durch doppelsträngige Bruchreparaturprozesse in den Kern - DNA (nDNA) . Es wurde nicht nur eine Korrelation zwischen dem Anteil nicht kodierender DNA und der Häufigkeit von NUMT im Genom gefunden, sondern es wurde auch nachgewiesen, dass NUMTs nicht zufällig verteilt sind und im Vergleich zu anderen eine höhere Wahrscheinlichkeit haben, an einer bestimmten Stelle des Genoms eingefügt zu werden. Je nach Ort der Insertion können NUMTs die Funktion der Gene stören. Darüber hinaus wirkt sich die De-novo-Integration von NUMT-Pseudogenen in das Kerngenom in einigen Fällen nachteilig aus und fördert verschiedene Erkrankungen und das Altern.
Die erste Anwendung des NUMT-Begriffs bei der Hauskatze ( Felis catus ) war auffallend, da die mitochondriale Genzahl und der Inhalt im nuklearen Genom der Katze 38-76X amplifiziert wurden, abgesehen von der Transponierung aus dem Zytoplasma. Die NUMTs-Sequenzen der Katze schienen aufgrund der Entdeckung mehrerer Mutationen, der Unterschiede in den mitochondrialen und nuklearen genetischen Codes und der offensichtlichen Insertion in typischerweise inerte Zentromerregionen nicht funktionsfähig zu sein. Das Vorhandensein von NUMT-Fragmenten im Genom ist nicht bei allen Arten problematisch; zum Beispiel wird gezeigt, dass Sequenzen mitochondrialen Ursprungs die nukleäre DNA-Replikation in Saccharomyces cerevisiae fördern . Obwohl die ausgedehnte Translokation von mtDNA-Fragmenten und deren Co-Amplifikation mit freier mitochondrialer DNA bei der Diagnose mitochondrialer Erkrankungen, beim Studium der Populationsgenetik und bei phylogenetischen Analysen problematisch war , haben Wissenschaftler NUMTs als genetische Marker verwendet, um die relative Rate der nuklearen und mitochondrialen Mutation und Wiederherstellung des Evolutionsbaums.
Kurze Geschichte von NUMT
Nach der Endosymbiose-Theorie , die sich um die 1970er Jahre durchsetzte, war das Mitochondrium als wichtige Energiefabrik der Zelle zuvor ein freilebender Prokaryont, der in eine eukaryontische Zelle eindrang. Nach dieser Theorie übertrugen symbiotische Organellen ihre Gene nach und nach auf das eukaryotische Genom, was bedeutet, dass mtDNA nach und nach in das Kerngenom integriert wurde. Trotz der metabolischen Veränderungen und funktionellen Anpassungen in den Wirtseukaryoten ist zirkuläre mitochondriale DNA in den Organellen enthalten. Die mitochondriale DNA enthält 37 Gene und spielt eine wesentliche Rolle bei der Produktion notwendiger Verbindungen, wie z. B. benötigter Enzyme für die ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass bestimmte Gene (wie die Gene für die Cytochromoxidase-Untereinheiten I und II) innerhalb der Organelle notwendig sind, um das Redoxgleichgewicht durch membranassoziierte Elektronentransportketten zu regulieren. Es wurde berichtet, dass diese Teile des mitochondrialen Genoms am häufigsten verwendet werden. Mitochondrien sind nicht der einzige Ort, an dem die mtDNA der Zelle, die mitochondriale DNA, gefunden werden kann; manchmal kann es zu einer Übertragung von mitochondrialer DNA von Organellen in den Zellkern kommen; der Beweis einer solchen Translokation wurde durch den Vergleich der mitochondrialen DNA-Sequenz mit der Genomsequenz der Gegenstücke gesehen. Die Integration und Rekombination von zytoplasmatischer mtDNA in die nukleäre DNA wird als nukleare mitochondriale DNA bezeichnet, die als NUMT abgekürzt wird. Das mögliche Vorhandensein von Organellen-DNA im Kerngenom wurde vorgeschlagen, nachdem eine homologe Struktur zur mitochondrialen DNA gefunden wurde, kurz nach der Entdeckung des Vorhandenseins einer unabhängigen DNA in den Organellen im Jahr 1967. Dieses Thema blieb bis in die 1980er Jahre unberührt. Erste Hinweise darauf, dass sich DNA zwischen Zellkompartimenten bewegen könnte, ergaben sich, als Fragmente von Chloroplasten-DNA im mitochondrialen Genom von Mais mithilfe von Kreuzhybridisierung zwischen Chloroplasten- und Mitochondrien-DNA und physikalischer Kartierung homologer Regionen gefunden wurden. Nach dieser ersten Beobachtung prägte Ellis den Namen "promiscuous DNA", um den intrazellulären DNA-Transfer von einer Organelle zur anderen zu bezeichnen und ist das Vorhandensein von Organellen-DNA in mehreren Zellkompartimenten. Dies ist nicht nur für sich genommen eine wichtige Entdeckung, sondern auch sehr aufschlussreich und hilfreich für das Verständnis des evolutionären Prozesses und des Zeitraums, in dem verschiedene Ereignisse stattfinden können. Die Suche nach mtDNA in nuklearer DNA wurde bis 1994 fortgesetzt, als kürzlich über die bemerkenswerte Transposition von 7,9 kb eines typischerweise 17,0 kb großen mitochondrialen Genoms in eine spezifische nukleäre chromosomale Position bei der Hauskatze berichtet wurde. Dies ist die Zeit, in der NUMT geprägt wurde, um die großen Abschnitte der mitochondrialen DNA im Genom zu bezeichnen. Bisher wurden die gesamten Genome vieler Eukaryoten, sowohl Wirbeltiere als auch Wirbellose , sequenziert und NUMT wurde im Kerngenom verschiedener Organismen beobachtet, darunter Hefe, Podospora , Seeigel , Heuschrecke , Honigbiene, Tribolium , Ratte, Mais , Reis und Primaten . In Plasmodium, Anopheles gambiae und Aedes aegypti Mücken NUMT sind kaum nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurden in Genomdaten von Ciona intestinalis , Neurospora crassa , Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster und Rattus norvegicus nur wenige konservierte Fragmente von NUMT identifiziert . Antunes und Ramos wurden 2005 zum ersten Mal unter Verwendung von BLAST N, MAFFT , sehr intensiven Genomkartierungen und phylogenen Analysen das Vorhandensein von NUMT im Fischgenom nachgewiesen . Quer durch das Tierreich, Apis mellifera , von Phylum Arthropoda und Hydra magnipapillata , von phylum Cnidaria , sind jeweils die ersten und zweiten Tieren , die mit dem höchsten Anteil von NUMTs auf die Gesamtgröße des Kerngenoms , während Monodelphis Domestica oder Grau kurzschwänzigen Opossum , ist der Rekordhalter für die NUMT-Häufigkeit bei Wirbeltieren. Ähnlich wie bei Tieren sind NUMTs in Pflanzen reichlich vorhanden, und es wurde über das längste bisher bekannte NUMT-Fragment, eine 620-kb-teilweise duplizierte Insertion der 367-kb-mtDNA von Arabidopsis thaliana , berichtet.
Mechanismus der NUMT-Einfügung
NUMT-Insertion in das nukleäre Genom und seine Persistenz im nuklearen Genom, initiiert durch die physische Abgabe von mitochondrialer DNA an den Nukleus. Auf diesen Schritt folgt die mtDNA-Integration in das Genom durch einen nicht-homologen Endverbindungsmechanismus während des Doppelstrangbruchs (DSB)-Reparaturprozesses, wie er sich bei der Untersuchung der Bäckerhefe Saccharomyces Cerevisiae vorgestellt hat; und endet durch intragenomische Dynamik der Amplifikation, Mutation oder Deletion, die auch als Modifikationen nach der Insertion bekannt ist. Der Mechanismus des mtDNA-Transfers in den Zellkern ist noch nicht vollständig verstanden.
Transfer der freigesetzten mtDNA in den Zellkern: Der erste Schritt des Transferprozesses ist die Freisetzung der mtDNA in das Zytoplasma. Thorsness und Fox demonstrierten die Relokationsrate von mtDNA aus den Mitochondrien in den Zellkern unter Verwendung des ura3- Hefestamms mit einem gentechnisch veränderten URA3- Plasmid , das ein Gen für die Uracil-Biosynthese benötigt, in den Mitochondrien. Während der Vermehrung solcher Hefestämme, die eine nukleäre ura3- Mutation tragen, komplementiert Plasmid-DNA, die aus dem Mitochondrium in den Nukleus entweicht, den Uracil- Biosynthesedefekt , was das Wachstum in Abwesenheit von Uracil wiederherstellt und den Phänotyp leicht bewertet. Die Geschwindigkeit des DNA-Transfers von den Mitochondrien in den Zellkern wurde auf 2 x 10-5 pro Zelle pro Generation geschätzt, während das Gegenteil, im Fall der cox2- Mutante, die Transferrate des Plasmids vom Zellkern in die Mitochondrien anscheinend bei liegt mindestens 100.000 mal weniger. Viele Faktoren steuern die Geschwindigkeit, mit der mtDNA aus den Mitochondrien in den Zellkern entweicht. Die höhere Mutationsrate der mtDNA im Vergleich zur nDNA in den Zellen vieler Organismen ist ein wichtiger Faktor, der den Transfer mitochondrialer Gene in das Kerngenom fördert. Einer der intergenen Faktoren, der zu der höheren Zerstörungsrate von mitochondrialen Makromolekülen, einschließlich mtDNA, führt, ist das Vorhandensein eines hohen Anteils an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in Mitochondrien als Nebenprodukte des ATP-Synthesemechanismus erzeugt werden. Einige andere Faktoren, die das Entweichen von mtDNA aus Mitochondrien beeinflussen, sind die Wirkung mutagener Stoffe und anderer Formen von zellulärem Stress, die Mitochondrien oder ihre Membranen schädigen können , was beweist, dass angenommen werden kann, dass exogene schädliche Stoffe (ionisierende Strahlung und chemische genotoxische Stoffe) zunehmen die Rate, mit der mtDNA in das Zytoplasma entweicht. Thorsness und Fox setzten ihre Forschungen fort, um die endogenen Faktoren zu finden, die das Entweichen der mtDNA in den Zellkern beeinflussen. Sie isolierten und untersuchten 21 Kernmutanten mit unterschiedlichen Kombinationen von Mutationen in mindestens 12 Kernloci, die als Yme- Mutationen ( Hefemitochondrienflucht ) bezeichnet werden, unter verschiedenen Umweltbedingungen, da einige dieser Mutationen Temperaturempfindlichkeit verursachen. Sie fanden heraus, dass diese Mutationen, die mitochondriale Funktionen aufgrund der Veränderung von Genprodukten stören, die mitochondriale Integrität beeinträchtigen und dazu führten, dass mtDNA in das Zytoplasma entweicht. Außerdem verändern Defekte in den Proteinen die Geschwindigkeit des mtDNA-Transfers in den Zellkern. Im Fall der yme1- Mutante werden beispielsweise abnorme Mitochondrien zum Abbau durch die Vakuole mit Hilfe von pep4 , einer Hauptproteinase, anvisiert , und der Abbau erhöht das Entweichen der mtDNA in den Zellkern durch den Prozess der Mitophagie. Darüber hinaus fanden Thorsness und Campbell, dass durch die Unterbrechung von pep4 die Häufigkeit des mtDNA-Entweichens in yme1- Stämmen abnimmt. In ähnlicher Weise verringert die Zerstörung von PRC1 , das für Carboxypeptidase Y kodiert , die Geschwindigkeit des mtDNA-Entweichens in yme1- Hefe. Es gibt Hinweise darauf, dass Mitophagie einer der möglichen Wege für den mtDNA-Transfer in den Zellkern ist und sich als der bisher am meisten unterstützte Weg erwiesen hat. Einige andere mögliche Wege sind in Abbildung 1 gezeigt. Der erste Weg ist, wie bereits erklärt wurde, eine yme1- Mutante, die zur Inaktivierung des YMe1p- Proteins, einer mitochondrial lokalisierten ATP-abhängigen Metalloproteinase , führt, was zu einer hohen Austrittsrate von mtDNA in den Zellkern führt . Mitochondrien des yme1- Stammes werden von der Vakuole häufiger zum Abbau aufgenommen als der Wildtyp-Stamm. Darüber hinaus haben zytologische Untersuchungen mehrere andere mögliche Wege in der unterschiedlichen Anzahl von Arten vorgeschlagen , darunter eine Lyse des mitochondrialen Kompartiments, eine direkte physikalische Verbindung und Membranfusion zwischen Mitochondrien und Zellkern sowie die Einkapselung mitochondrialer Kompartimente innerhalb des Zellkerns, wie in Abbildung 1 gezeigt .
Vorbereitung vor der Insertion: Nach Erreichen des Kerns muss mtDNA in das Kerngenom eindringen. Es kann erwartet werden, dass die Geschwindigkeit des mtDNA-Einbaus in das Kerngenom von der DSB-Zahl in der nDNA, der Aktivität der DSB-Reparatursysteme und der Geschwindigkeit des mtDNA-Entweichens aus den Organellen abhängt. Die MtDNA-Insertion umfasst drei Hauptprozesse, die in Abbildung 2 dargestellt sind; erstens muss die mtDNA die richtige Form und Sequenz haben; mit anderen Worten, die mtDNA muss editiert werden, was zu der neuen editierten Stelle in der Polynukleotidstruktur führt. Mitochondriale DNA ist nicht universell und bei pflanzenähnlichen Tieren zeigt die mitochondriale Bearbeitung sehr unregelmäßige Muster taxonspezifischer Vorkommen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gibt es drei Möglichkeiten, wie mtDNA für die Insertion in die nukleäre DNA vorbereitet werden kann. Der Prozess hängt hauptsächlich von der Zeit ab, in der mtDNA in den Zellkern transferiert wird. Wie in Abbildung 2b gezeigt, ist die direkte Integration von unbearbeiteten mtDNA-Fragmenten in die Kerngenome am plausibelsten und die Beweise wurden sowohl in Pflanzen, Arabidopsis-Genom als auch in Tieren mit Hilfe verschiedener Methoden, einschließlich BLAST-basierter Analyse, gefunden. Dabei wird mtDNA in den Zellkern transferiert, wodurch später im Mitochondrium Editing und Introns entstehen. Wenn ein Gen zum Beispiel in einer Linie in den Zellkern übertragen wurde, bevor sich die mitochondriale Editierung entwickelte, aber in anderen Linien, in denen die Editierung auftrat, in der Organelle verblieb, würde die Kernkopie einem bearbeiteten Transkript ähnlicher erscheinen als den verbleibenden mitochondrialen Kopien bei die bearbeiteten Seiten. Ein weiteres vertretenes und weniger unterstütztes Modell, Abbildung 2a, ist das cDNA- vermittelte Modell, bei dem intronhaltige mtDNA in den Zellkern eindringt und durch reverse Transkription des gespleißten und editierten mitochondrialen Transkripts in die nDNA integriert wird. Der dritte vorgeschlagene Mechanismus ist der direkte Transfer und die Integration von intronloser mtDNA in den Zellkern, Abbildung 2c, wobei Editing und Introns im Mitochondrium während der Evolution kommen und gehen. In diesem Fall erfolgt die Einführung und Entfernung des Introns sowie die reverse Transkription innerhalb der Mitochondrien und das Endprodukt, die bearbeitete intronlose mtDNA, wird nach dem Transfer in den Zellkern in die nDNA integriert.
Insertion in das Kerngenom: Nachdem der Vorbereitungsschritt abgeschlossen ist, kann mtDNA in das Kerngenom eingefügt werden. Basierend auf der NUMT-Integrationsstelle und den analysierten Ergebnissen aus dem Bäckerhefe-Experiment stellten Blanchard und Schmidt die Hypothese auf, dass mtDNA über nicht-homologe Endverbindungsmaschinen in den Doppelstrangbruch (DSB) eingefügt wird. Die Hypothese wird allgemein akzeptiert. Spätere Analysen stimmten mit der Beteiligung von NHEJ an der NUMT-Integration beim Menschen überein. Diese Prozesse finden sowohl in somatischen als auch in Keimbahnzellen statt . Bei Tieren und Menschen hängt die Fähigkeit der DSB-Reparatur in Keimbahnzellen jedoch vom oogenetischen und spermatogenetischen Stadium ab, dennoch sind reife Spermien aufgrund der geringen Reparaturaktivität nicht zur DSB-Reparatur in der Lage. Darüber hinaus kann DSB auch durch homologe Rekombination (HR) repariert werden , was genauer ist und weniger Fehler in den Reparaturprozess einführt, während dies beim Prozess der mtDNA-Insertion noch nicht vorgekommen ist. Abgesehen von kanonischem NHEJ werden DSBs über einen Mechanismus repariert, der Sequenzen umfasst, die einige wenige homologe Nukleotide an den Enden eines zu ligierenden DSB enthalten. Dieser Mechanismus ist als Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung bekannt, abgekürzt als MMEJ. MMEJ ist der mutagene DSB - Reparaturmechanismus aufgrund Erzeugung von Deletionen, Insertion verschiedener Größen und anderen Genomumlagerungen in Säugetieren. Wie in Abbildung 3 gezeigt, umfassen die Prozesse der mtDNA-Insertion und DSB-Reparatur einige Schritte, nämlich DNA-Segment-Ausrichtung, DNA-Endverarbeitung, DNA-Synthese und Ligation. In jedem Schritt sind bestimmte Proteinkomplexe erforderlich, um das Auftreten der angegebenen Ereignisse zu erleichtern. Wie in Abbildung 3, in NHEJ gezeigt, ist die Ku70 / Ku80 Heterodimer und DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) , zu bringen , DNA - Fragmente zusammen enden, die Artemis Nuclease und Polynucleotid - Kinase 3' Phosphatase (PNKP) , für die Endverarbeitung , DNA-Polymerasen der X-Familie (Pol μ und Pol λ) und terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) , für die DNA-Synthese, und XLF/XRCC4/LigIV- Komplex, um die Reparatur abzuschließen und die Enden über eine Phosphodiesterbindung zu verbinden, sind die beteiligten Proteinkomplexe im DSB-Reparaturprozess in vielen höheren Organismen. DNA-Polymerasen (Pol μ und Pol λ) und XLF/XRCC4/LigIV- Komplex werden von zwei NHEJ- und MMEJ-Reparaturmaschinen geteilt und haben bei beiden Reparaturprozessen die gleiche Verantwortung. Der erste Schritt von MMEJ erfolgt durch WRN- , Artemis-, DNA- PK- und XRCC4- Proteinkomplexe, die die Enden von DSB- und mtDNA-Fragmenten verarbeiten und zusätzlich ausrichten, damit Polymerasen und Ligasen die NUMT-Insertion abschließen können (Abbildung 3 ).
Post-Insertions-Modifikation: Das komplexe Muster von NUMT im Vergleich mit dem einzelnen mitochondrialen Stück, das Auftreten von nicht-kontinuierlicher mitochondrialer DNA im Kerngenom und möglicherweise unterschiedliche Orientierung dieser Fragmente sind der Beweis für Post-Insert-Prozesse von NUMT innerhalb das Kerngenom. Die Ursache dieser komplexen Muster könnte das Ergebnis mehrerer NUMT-Einfügungen an Einfügungs-Hotspots sein. Außerdem trägt die Duplizierung nach dem Einfügen zur NUMT-Diversität bei. NUMTs haben keinen selbstreplizierenden Mechanismus oder Transpositionsmechanismus; daher wird erwartet, dass die NUMT-Duplikation parallel erfolgt oder eine größere segmentale Duplikation mit für den Rest des Genoms repräsentativen Raten umfasst. Beweise für NUMT-Duplikationen, die nicht in der Nähe anderer NUMTs liegen, sind in vielen Genomen vorhanden und treten wahrscheinlich als Teil einer segmentalen Duplikation auf. Allerdings scheinen Duplikationen rezenter humanspezifischer NUMTs als Teil einer segmentalen Duplikation selten zu sein; beim Menschen wurde festgestellt, dass nur wenige NUMTs mit segmentaler Duplikation überlappen, und diese NUMTs wurden nur in einer der Kopien gefunden, während sie bei den anderen fehlten, was eindeutig zeigt, dass die NUMTs nach den Duplikationsereignissen eingefügt wurden. Deletion ist eine weitere NUMT-Post-Insertional-Modifikationsmethode, die noch nicht so detailliert wie eine Insertion untersucht wurde. Eine ständige Erosion phylogener Signale und eine hohe Mutationsrate in tierischer mtDNA erschweren die Erkennung solcher Modifikationen, insbesondere Deletionen. Die Untersuchung der Fälle, in denen das Anwesenheits-Abwesenheits-Muster von NUMTs nicht mit dem phylogenetischen Baum übereinstimmt , sollte den Nachweis kürzlicher NUMT-Verluste mithilfe von multiplen Genom-Alignments mit dem Vorhandensein einer Fremdgruppe ermöglichen. Bensasson und seine Teammitglieder verwendeten diese Methode, um die älteste inserierte NUMT im Menschen zu schätzen, die vor etwa 58 Millionen Jahren datiert wurde.
Allgemeine Eigenschaften von NUMT
Da sich die Anzahl der Mitochondrien und ihr Funktionsniveau zwischen eukaryontischen Organismen unterscheiden, variieren Länge, Struktur und Sequenz von NUMTs dramatisch. Forscher haben herausgefunden, dass die jüngsten NUMT-Insertionen aus verschiedenen Segmenten des mitochondrialen Genoms stammen, einschließlich der D-Schleife und in einigen extremen Fällen einer Reihe von fast dem vollständigen mitochondrialen Genom. Die Sequenz, Häufigkeit, Größenverteilung und sogar die Schwierigkeiten, diese Sequenzen im Genom zu finden, variieren erheblich zwischen den Arten. Die meisten DNA-Fragmente, die von Mitochondrien und Plastiden in das Kerngenom übertragen werden, sind kleiner als 1 kb. Dennoch werden in einigen Pflanzengenomen extrem große Fragmente von Organellen-DNA gefunden.
Da sich das Genom im Laufe der Zeit durch Mutation weiterentwickelt und verändert, variiert die Anzahl der NUMT im Genom im Laufe der Evolution. NUMT dringt in den Zellkern ein und fügt sich zu verschiedenen Zeitpunkten in die nDNA ein. Aufgrund der ständigen Mutation und Instabilität von NUMT variiert die Ähnlichkeit dieses Genomabschnitts mit der mtDNA im Königreich Animalia und sogar innerhalb eines bestimmten Genoms stark. Zum Beispiel beträgt die neueste Zahl von NUMT, die im menschlichen Genom aufgezeichnet wurde, 755 Fragmente, die von 39 bp bis fast zur gesamten mitochondrialen Sequenz reichen. Es gibt 33 paraloge Sequenzen mit über 80% Sequenzähnlichkeit und einer Länge von mehr als 500 bp. Darüber hinaus sind nicht alle NUMT-Fragmente im Genom das Ergebnis einer mtDNA-Migration; einige sind das Ergebnis der Amplifikation nach der Insertion. Es wurde festgestellt, dass alte NUMTs im menschlichen Genom häufiger vorkommen als die neueren Integranten, was darauf hindeutet, dass mtDNA nach der Insertion amplifiziert werden kann. Dayamaet al. eine neue Technik mit hoher Ausbeute zum genauen Nachweis der Anzahl von NUMT im menschlichen Genom namens dinumt entwickelt . Diese Methode ermöglicht es ihr und ihren Teammitgliedern, NUMT-Insertionen aller Größen in den gesamten Genomen, die mit der Paired-End-Sequenzierungstechnologie sequenziert wurden, mit größerer Sensitivität zu identifizieren. Sie wendeten Dinumt auf 999 Personen aus dem 1000 Genomes Project und dem Human Genome Diversity Project (HGDP) an und führten eine aktualisierte Anreicherungsanalyse beim Menschen unter Verwendung dieser polymorphen Insertionen durch. Die weitere Untersuchung und Genotypisierung des entdeckten NUMT analysiert auch das Insertionsalter, den Ursprung und die Sequenzmerkmale. Schließlich bewerteten sie ihren möglichen Einfluss auf laufende Studien zur mitochondrialen Heteroplasmie.
Wie bereits erwähnt, wird mtDNA nur dann in das Kerngenom eingefügt, wenn ein DSB durch endogene oder exogene schädigende Faktoren produziert wird. mtDNA wird jedoch an keiner Stelle innerhalb des Genoms eingefügt. Darüber hinaus gibt es keine Korrelation zwischen dem Anteil an nicht-kodierender DNA und der NUMT-Häufigkeit; Darüber hinaus fanden Antunes und Ramos während ihrer intensiven Arbeit an der NUMT-Sequenz in Fischen mit der BLASTN-Analysemethode heraus, dass alte NUMTs bevorzugt in die bekannten und vorhergesagten Loci eingefügt werden, wie sie für neuere NUMTs im menschlichen Genom abgeleitet wurden. Daher wurde basierend auf diesen Studien festgestellt, dass die Insertion von NUMT in das Kerngenom nicht zufällig ist. Eine der besten Studien, die die nicht-zufällige Verteilung und Einfügung von NUMTs in das Kerngenom belegt, wird von Tsuji und seinen Teamkollegen durchgeführt. Mit der LAST-Methode anstelle von BLAST, die die Berechnung des E-Werts mit höherer Genauigkeit ermöglicht und die sich wiederholenden Elemente in NUMT-Flanken nicht unterrepräsentiert, konnten Tsuji und sein Teamkollege den Ort der NUMT-Einfügung präzise charakterisieren. Sie fanden heraus, dass NUMT-Fragmente dazu neigen, in Regionen mit hoher lokaler DNA-Krümmung oder Biegbarkeit und hohen A+T-reichen Oligomeren, insbesondere TAT, inseriert zu werden. Darüber hinaus werden NUMTs meist in offene Chromatinregionen eingefügt. Mit der gleichen Methode zeigte Tsuji, dass NUMTs normalerweise nicht geclustert sind und die von D-Loop produzierten NUMTs normalerweise unterrepräsentiert sind, was bei Affen und Menschen im Vergleich zu Ratten und Mäusen aufgrund der Gesamtlänge ihrer NUMTs deutlicher sichtbar ist. Tsuji fand jedoch auch heraus, dass die Retrotransposon-Struktur in NUMT-Flanken stark angereichert ist und die meisten NUMTs in unmittelbarer Nähe des Retrotransposons eingefügt werden, während nur wenige, 10 von 557 NUMTs, innerhalb eines Retrotransposons eingefügt wurden, konnten sie keine klare Beziehung zur Größe von . finden nicht-kodierende DNA und die Anzahl der NUMT.
Folgen der De-Novo-Integration von NUMT-Inserts
NUMTs sind nicht völlig funktionslos und werden mit bestimmten Funktionen verbunden. Obwohl die Insertion von NUMTs früher als funktionslose Pseudogene galt, haben sich neuere humane NUMTs als potenziell mutagener Prozess erwiesen, der die funktionelle Integrität des menschlichen Genoms schädigen könnte. Die Anhäufung von Mutationen in NUMT, post-insertionelle Veränderung, mutagen Mechanismus der NUMT Insertion, MMEJ und NHEJ, DSB, sowie der Ort , in dem Einsetzen Hot Spot befindet, kann Mutation und dramatische Veränderungen der Genomstruktur an der Integrationsstelle verursachen , stören die Funktion des Genoms und üben erhebliche Auswirkungen auf die Expression der genetischen Information aus. Darüber hinaus beeinflusst die Integration von mtDNA-Sequenzen wesentlich die räumliche Organisation der nDNA und könnte eine wichtige Rolle bei der Evolution eukaryotischer Genome spielen. Neben dem negativen Effekt der mtDNA stellen diese konservierten alten NUMTs im Genom wahrscheinlich evolutionäre Erfolge dar und sollten als potenzieller evolutionärer Mechanismus zur Verbesserung genomischer Kodierungsregionen betrachtet werden. Darüber hinaus fanden Chatre und Ricchetti mit der Anwendung von Zweidimensionaler Gelelektrophorese , Plasmidkonstrukt , Mutagenese , in einer sillico-Analyse von ACS- Motiven und Plasmidverlustraten-Assay, dass wandernde mitochondriale DNAs die Replikation der Kernregion, in der sie sich befinden, beeinflussen können eingefügt. Durch ihre funktionellen Beweise zeigten sie, dass Sequenzen mitochondrialen Ursprungs die nDNA-Replikation in Saccharomyces cerevisiae fördern . NUMTs sind eine reiche 11-bp- ARS- Core-A-Konsensussequenz (ACS), deren Anwesenheit in den Übereinstimmungen mit diesen Konsensusmotiven im Replikationsursprung von Saccharomyces cerevisiae notwendig, aber nicht ausreichend für die Funktion des Replikationsursprungs und jeder Mutation in . ist dieser Konsens verursacht die Verringerung oder den Verlust der DNA-Replikationsaktivität. Angesichts der hohen Dichte von ACS-Motiven erscheinen einige NUMTs im Wesentlichen als ACS-Träger. Im Gegensatz dazu ist die Replikationseffizienz bei den Hefestämmen höher, die Plasmide haben, die sowohl NUMT als auch ARS enthalten. Sie fanden auch heraus, dass einige NUMTs als unabhängige Replikationsgabel und späte chromosomale Ursprünge fungieren können und NUMTs, die sich in der Nähe von oder innerhalb von ARS befinden, Schlüsselsequenzelemente für die Replikation bereitstellen. Somit können NUMTs als unabhängige Ursprünge fungieren, wenn sie in einen geeigneten genomischen Kontext eingefügt werden oder die Effizienz bereits existierender Ursprünge beeinflussen.
Krankheiten und Störungen: Die NUMT-Insertion in das Genom kann problematisch sein. Die Transposition von NUMTs in das Genom wurde auch mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die De-novo-Integration von NUMT-Pseudogenen in das Kerngenom hat in einigen Fällen negative Auswirkungen und fördert verschiedene Erkrankungen und Alterung. Die Integration von MtDNA in kodierende Gene der Keimbahnzellen hat dramatische Folgen für die Embryonalentwicklung und ist in vielen Fällen tödlich. Nur wenige NUMT-Pseudogene, die mit Krankheiten assoziiert sind, werden innerhalb von Exons oder an den Exon-Intron-Grenzen menschlicher Gene gefunden. Zum Beispiel erben die Patienten mit Mukolipidose- Syndrom eine Mutation, die durch die Insertion eines 93bp-Fragments von mitochondrialem ND5 in das Exon 2 des R403C-Mukolipin-Gens verursacht wird. Dies ist der erste Fall einer Erbkrankheit aufgrund des NUMT-Inserts. Trotz der kleinen Behandlungsgruppe erwies sich die Stammzelltransplantation als wirksam und die lysosomalen Enzymspiegel schienen sich in mindestens einem Fall nach der Transplantation zu normalisieren. Das Pallister-Hall-Syndrom , eine Entwicklungsstörung, in einem anderen Beispiel, bei der eine funktionelle Störung eines Schlüsselgens der Entwicklung aus einer de novo- Insertion eines 72bp-mtDNA-Fragments in das GLI3- Exon 14 in Chromosom 7 resultiert, was zu einer zentralen und postaxialen Polydaktylie führt. bifid Epiglottis, unperforierten Anus, Nieren Abnormalitäten einschließlich zystischer Mißbildungen, Nierenhypoplasie , ektopische Implantation Harnleiter und Lungensegmentierungs Anomalien wie bilaterale bilobed Lungen. Eine Mutation an der Spleißstelle im menschlichen Gen für Plasmafaktor VII, die einen schweren Plasmafaktor-VII-Mangel, Blutungskrankheit, verursacht, resultiert aus einer 251-bp-NUMT-Insertion. Als letztes bekanntes Beispiel ist die NUMT eine 36-bp-Insertion in Exon 9 des USH1C-Gens, die mit dem Usher-Syndrom Typ IC assoziiert ist. Für das Usher- Syndrom wurde noch kein sicherer Fluch gefunden , jedoch findet eine aktuelle klinische Studie an 18 Freiwilligen statt, um den Einfluss von UshStat sowohl kurz- als auch langfristig zu bestimmen. Diese Studie wurde im September 2013 begonnen und wird voraussichtlich bis Oktober 2023 abgeschlossen sein.
Altern: Mehrere Studien deuteten darauf hin, dass das De-novo-Auftreten von NUMT-Pseudogenen im Genom somatischer Zellen von ätiologischer Bedeutung für die Karzinogenese und das Altern sein kann. Um die Beziehung zwischen Alterung und NUMT im Kerngenom aufzuzeigen, verwendeten Cheng und Ivessa mutierte yme1-1- Stämme von Saccharomyces Cerevisiae, die eine höhere mtDNA-Migrationsrate aufweisen. Die Methode ist genau dieselbe wie die Methode, die Thorsness und Fox verwendet haben, um die wichtigen Mechanismen und Faktoren für die mtDNA-Migration in den Zellkern zu bestimmen. Sie fanden heraus, dass Hefestämme mit erhöhten Migrationsraten von mtDNA-Fragmenten in den Kern eine beschleunigte chronologische Alterung zeigten, während Stämme mit verringerten mtDNA-Transferraten in den Kern eine verlängerte CLS-, chronologische Lebensdauer aufwiesen, die möglicherweise auf die Wirkung von NUMT . zurückzuführen ist auf nukleare Prozesse einschließlich DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Gentranskription. Die Wirkung von NUMT auf die höheren eukaryotischen Organismen wurde von Caro und seinen Teamkollegen an Ratten als Modellorganismus untersucht. Mit einer Echtzeit-PCR-Quantifizierung, in situ-Hybridisierung von mtDNA an nDNA und Vergleich von jungen und alten Ratten konnten Caro und seine Crew nicht nur die hohe Konzentration von Cytochromoxidase III und 16S rRNA aus mtDNA sowohl bei jungen als auch bei alten Ratten bestimmen , aber sie konnten auch herausfinden, wie die Zahl der mitochondrialen Sequenzen in der nDNA mit zunehmendem Alter der Ratte zunimmt. Basierend auf diesen Erkenntnissen können Mitochondrien ein wichtiger Auslöser des Alterns sein, aber das letzte Ziel könnte auch der Zellkern sein.
Krebs: Die schrecklichsten Auswirkungen der NUMT-Insertion treten auf, wenn die mtDNA in die regulatorische Region oder in nukleare Strukturgene eingefügt wird und die lebenswichtigen Zellprozesse stört oder verändert. Bei primären niedriggradigen Hirnneoplasmen beispielsweise half die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse bei der Erkennung von mtDNA, die im Zellkern lokalisiert ist, in Korrelation mit einer Gesamterhöhung des mtDNA-Gehalts in der Zelle. Dieses ontogenetisch frühe Ereignis ist für die Ätiologie dieser Tumoren wichtig. In ähnlicher Weise sind mtDNA-Sequenzen in Hepatomzellen im Kerngenom mit einer höheren Kopienzahl im Gegensatz zu normalen Geweben vorhanden. Ein weiteres Beispiel wäre HeLa- nDNA, die Sequenzen enthält, die mit mtDNA-Fragmenten von ungefähr 5 kb hybridisieren. Eine Analyse zeigte, dass nDNA von malignen Zellen Sequenzen der mitochondrialen Cytochromoxidase I- , ND4- , ND4L- und 12S-rRNA-Gene enthält. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde angenommen, dass mtDNA-Fragmente als mobiles genetisches Element bei der Initiierung der Karzinogenese fungieren . Southern Blotting ist die Methode zur Bestimmung der Häufigkeit der mitochondrialen Insertion in nDNA von normalen und Tumorzellen von Mäusen und Ratten, die bewies, dass die mtDNA-Sequenzen in der nDNA von Nagetiertumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen viel zahlreicher und häufiger sind . Mit FISH-Sonden, PCR und Datensequenzierung, Kartierung und Vergleich fanden Ju und sein Teamkollege heraus, dass die mitochondrialen und nuklearen Genomfusionen mit einer ähnlichen Geschwindigkeit pro DNA-Basenpaar wie interchromosomale nukleäre Umlagerungen auftreten, was auf das Vorhandensein einer hohen Häufigkeit von Kontakten zwischen mitochondriale und nukleäre DNA in einigen somatischen Zellen. Außerdem untersuchten Ju und seine Teamkollegen den Zeitpunkt der somatischen mtDNA-Integration in das Kerngenom, indem sie Fälle bewerteten, in denen zusätzlich zum Primärtumor eine metastatische Probe sequenziert worden war. In einigen Fällen sind mtDNA-Transfers in den Zellkern somatischer Zellen sehr häufig und können nach der neoplastischen Bildung und im Verlauf der subklonalen Evolution von Krebs auftreten, was darauf hindeutet, dass dieses Ereignis in den gemeinsamen Vorfahren-Krebsklonen oder in normalen somatischen Zellen vor der neoplastische Veränderung. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Vorhandensein einer direkten Korrelation zwischen NUMT und Krebs in verschiedenen Körperorganen besteht. Das Verständnis der Beziehung, des Timings der NUMT-Insertion, der Position der Insertion und der gestörten Gene würde helfen, leistungsfähigere und wirksamere Medikamente herzustellen.
Experimentelle Verwendungen und Fehler
Obwohl das Verständnis der nicht-zufälligen Insertion von NUMT und die Ausführung bestimmter Funktionen nach der Insertion bei der Aufdeckung der Struktur und der Bestimmung der vollständigen Funktion des Genoms, insbesondere des menschlichen Genoms, hilft, wurden NUMTs als experimentelle Werkzeuge verwendet und waren sogar in verschiedenen biologischen Bereichen von Vorteil bevor Sie Kenntnisse über die Funktion von NUMTs haben. NUMTs können beispielsweise nicht nur als genetische Marker verwendet werden, sondern auch als Werkzeug zum Verständnis der relativen Mutationsrate im Zellkern und in den Mitochondrien sowie zur Wiederherstellung von Evolutionsbäumen. Der fortschreitende Prozess der NUMT-Integration in das Kerngenom wird durch die Entdeckung von NUMTs belegt, die nach der Mensch-Schimpansen-Divergenz in das menschliche Genom eingefügt wurden. Einige dieser NUMTs sind in Bezug auf das Vorhandensein oder Fehlen des Genoms variabel, was darauf hinweist, dass sie erst vor kurzem in der menschlichen Population aufgetreten sind, was es ihnen ermöglicht, als genetische Marker für die Abstammungslinie verwendet zu werden. Mit einem Protokoll, das auf Genom-Alignment basiert, um die Anzahl von NUMT in eng verwandten Arten abzuschätzen, konnten Hazkani-Covo und Graur nicht nur evolutionäre Ereignisse identifizieren, die die NUMT-Zusammensetzung in jedem Genom beeinflusst haben, sondern konnten auch die NUMT-Struktur im gemeinsamen Vorfahren von rekonstruieren Mensch und Schimpanse. NUMTs können auch verwendet werden, um die Rate der Evolution nichtfunktioneller Kernsequenzen mit der von funktioneller mtDNA zu vergleichen und die Evolutionsrate durch die Rate der Mutationsakkumulation entlang der NUMT-Sequenzen im Laufe der Zeit zu bestimmen. Die am wenigsten selektiv eingeschränkten Regionen sind die Segmente mit der größten Divergenz von der mitochondrialen Sequenz. Eine der vielversprechendsten Anwendungen der NUMT-Studie ist ihre Verwendung bei der Untersuchung von Kernmutationen. In metazoans , NUMTs ist nicht-funktional betrachtet. Daher können Kernmutationen von mitochondrialen Veränderungen unterschieden werden und die Untersuchung von Nukleotidsubstitution, Insertion und Deletion wäre möglich. Darüber hinaus ermöglicht die Homologie paraloger NUMT-Sequenzen mit der mtDNA das Testen auf lokale Sequenzeffekte auf die Mutation. All diese Informationen, die aus der Untersuchung von NUMT-Fragmenten gewonnen wurden, könnten verwendet werden, um die mitochondriale Evolution sowie evolutionäre Prozesse im Laufe der Geschichte zu verstehen.
NUMTs bieten die Möglichkeit, die antike Diversität mitochondrialer Abstammungslinien zu studieren und prähistorische Interspezies-Hybridisierungen zu entdecken. Uralte Hybridisierungen wurden zuerst (unter Verwendung von NUMTs) in Borstenschwänzen, dann in Kolobin-Affen und zuletzt in einem direkten menschlichen Vorfahren nachgewiesen. Die Hominidenhybridisierung geschah etwa zur Zeit der Trennung von Mensch / Schimpanse / Gorilla . Diese letztere Studie betrifft eine menschliche NUMT, die mit Schimpansen und Gorillas geteilt wird. Die gemeinsame Phylogenie der drei NUMT-Sequenzen und der mitochondrialen Genome von Menschenaffen deutet darauf hin, dass ein gemeinsamer Vorfahre der drei NUMTs von einer Hominiden-Spezies, die durch etwa 4,5 Millionen Jahre mtDNA-Evolution von ihnen getrennt ist, auf die Linie Mensch/Schimpanse/Gorilla übertragen wurde. Während eine Hybridisierung dieser Größenordnung bei Primaten keine Seltenheit ist, ist ihr Auftreten in der direkten menschlichen Abstammungslinie, um den kritischen Zeitpunkt der Mensch/Affen-Artenbildung, ein überraschendes Ergebnis. Zusätzliche NUMTs mit ähnlichen Phylogenien weisen darauf hin, dass solche Ereignisse möglicherweise nicht einzigartig sind.
Ein weiteres Problem ergab sich aus dem Vorhandensein von NUMT im Genom, das mit der Schwierigkeit verbunden ist, die genaue Anzahl der mitochondrialen Insertionen in die nDNA zu bestimmen. Die genaue Anzahl der NUMT-Pseudogene für eine Art zu bestimmen ist aus mehreren Gründen eine schwierige Aufgabe. Ein Grund, der den Nachweis von NUMT-Sequenzen erschwert, ist die Veränderung dieser Sequenzen durch Mutation und Deletion. Zwei weitere wesentliche Hindernisse erschweren die Erkennung von NUMT sehr; Erstens die fehlende Korrelation zwischen dem Anteil der nicht-kodierenden nDNA und der Anzahl der NUMT-Inserts im Kerngenom. Das heißt, die NUMT-Insertion könnte in der bekannten oder vorhergesagten kodierenden Region, sowohl im Intron als auch im Exon, statt nur in der intergenen und intronischen Region erfolgen. Zweitens ist mitochondriale DNA, die in tierische Kerngenome integriert ist, hauptsächlich auf Tiere mit zirkulären mitochondrialen Genomen ohne Introns beschränkt. NUMT-Studien an Tieren mit linearen mitochondrialen Genomen oder solchen mit Intron-haltigen Mitochondrien liegen nicht vor. Daher bleibt trotz aller verfügbaren fortschrittlichen Technologien zu bestimmen, ob NUMT-Transpositionsunterschiede zwischen zirkulären und linearen mtDNAs bestehen.
Diese Schwierigkeiten, das Vorhandensein von NUMT zu erkennen, können problematisch sein. Translozierte mitochondriale Sequenzen im Kerngenom haben das Potenzial, zusätzlich oder sogar anstelle der authentischen mtDNA-Zielsequenz amplifiziert zu werden, was populationsgenetische und phylogenetische Analysen ernsthaft durcheinanderbringen kann, da mtDNA weit verbreitet für Populationskartierung, evolutionäre und phylogenetische Studien verwendet wird , Artenidentifizierung durch DNA-Barcode, Diagnose verschiedener Pathologien und Gerichtsmedizin. Diese gleichzeitige Amplifikation von NUMT mit freier extrachromosomaler mtDNA verhindert zudem, dass die genaue Anzahl von NUMT-Fragmenten im Genom verschiedener Organismen, wie Aedes aegypti- Mücken, insbesondere solchen, bei denen eine ausgedehnte Translokation von mtDNA-Fragmenten stattfindet, bestimmt wird. Dies erschwert die Diagnose bestimmter mitochondrialer Erkrankungen. Auf Chromosom 1 wurde beispielsweise ein großes NUMT-Pseudogen gefunden, während eine neuere Analyse derselben Sequenz zu dem Schluss führte, dass die mtDNA der Spermien Mutationen aufweist, die eine geringe Spermienmobilität verursachen. Ein weiteres Beispiel wäre der jüngste Bericht, der ein heteroplasmatisches mtDNA-Molekül beschreibt, das fünf verknüpfte Missense-Mutationen enthält, die über die angrenzenden mtDNA- CO1- und CO2- Gene bei Alzheimer- Patienten verteilt sind dass die nuklearen CO1- und CO2-Sequenzen zeigten, dass sie etwa 770.000 Jahre zuvor in der frühen Evolution der Hominiden von modernen menschlichen mtDNAs abwichen und diese konservierten NUMTs die Alzheimer-Krankheit verursachen könnten. Eine der möglichen Möglichkeiten, solche fehlerhaften Ergebnisse zu verhindern, ist eine Amplifikation und ein Vergleich der heterogenen Sequenz, die sowohl mtDNA als auch nDNA umfasst, mit den erhaltenen Ergebnissen der Sanger-Sequenzierung von gereinigter und angereicherter mtDNA, wie in Abbildung 4 gezeigt. Obwohl diese Methode einfach ist und nur wenige Primer erforderlich sind, verhindert es einen wesentlichen Fehler bei phylogenetischen Studien einer Population und alle zuvor erwähnten falschen Ergebnisse.
Verweise
Siehe auch