Ursprung der Replikation - Origin of replication
Der Replikationsstartpunkt (auch Replikationsstartpunkt genannt ) ist eine bestimmte Sequenz in einem Genom, an der die Replikation initiiert wird. Die Vermehrung des genetischen Materials zwischen den Generationen erfordert eine rechtzeitige und genaue Vervielfältigung der DNA durch semikonservative Replikation vor der Zellteilung, um sicherzustellen, dass jede Tochterzelle das vollständige Chromosomenkomplement erhält . Dabei kann es sich entweder um die Replikation von DNA in lebenden Organismen wie Prokaryoten und Eukaryoten oder die von DNA oder RNA in Viren wie doppelsträngigen RNA-Viren handeln . Die Synthese von Tochtersträngen beginnt an diskreten Stellen, die als Replikationsstartpunkte bezeichnet werden, und verläuft bidirektional, bis die gesamte genomische DNA repliziert ist. Trotz der fundamentalen Natur dieser Ereignisse haben Organismen überraschend unterschiedliche Strategien entwickelt, die den Beginn der Replikation kontrollieren. Obwohl die spezifische Struktur und Erkennung des Replikationsstartpunkts von Art zu Art variiert, sind einige gemeinsame Merkmale gemeinsam.
Geschichte
In der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts legten Gregor Mendels bahnbrechende Arbeiten zur Vererbung von Merkmalen bei Erbsenpflanzen nahe, dass bestimmte „Faktoren“ (heute als Gene etabliert) für die Übertragung von Organismenmerkmalen zwischen den Generationen verantwortlich sind. Obwohl zunächst Proteine als Erbgut angenommen wurden, etablierten Avery, MacLeod und McCarty ein Jahrhundert später die von Friedrich Miescher entdeckte DNA als Träger der Erbinformation. Diese Ergebnisse ebneten den Weg für die Forschung zur Aufdeckung der chemischen Natur der DNA und der Regeln für die Kodierung genetischer Informationen und führten schließlich zu dem Vorschlag der doppelhelikalen Struktur der DNA von Watson und Crick . Dieses dreidimensionale DNA-Modell beleuchtete potenzielle Mechanismen, mit denen die genetische Information vor der Zellteilung auf semikonservative Weise kopiert werden konnte, eine Hypothese, die später von Meselson und Stahl experimentell unterstützt wurde, indem Isotopeneinbau verwendet wurde, um elterliche von neu synthetisierter DNA zu unterscheiden. Die anschließende Isolierung von DNA-Polymerasen, den Enzymen, die die Synthese neuer DNA-Stränge katalysieren, durch Kornberg und Kollegen leistete Pionierarbeit bei der Identifizierung vieler verschiedener Komponenten der biologischen DNA-Replikationsmaschinerie, zunächst im bakteriellen Modellorganismus E. coli , später aber auch in eukaryotische Lebensformen.
Merkmale
Eine wichtige Voraussetzung für die DNA-Replikation ist, dass sie genau einmal pro Zellzyklus mit extrem hoher Genauigkeit und Effizienz erfolgen muss , um die Anhäufung genetischer Veränderungen mit potenziell schädlichen Folgen für das Überleben der Zellen und die Lebensfähigkeit des Organismus zu verhindern. Unvollständige, fehlerhafte oder vorzeitige DNA-Replikationsereignisse können zu Mutationen, chromosomaler Polyploidie oder Aneuploidie und Variationen der Genkopienzahl führen, die wiederum zu Krankheiten, einschließlich Krebs, führen können. Um eine vollständige und genaue Duplizierung des gesamten Genoms und den korrekten Fluss der genetischen Information zu den Nachkommenzellen zu gewährleisten, werden alle DNA-Replikationsereignisse nicht nur durch Zellzyklus-Signale streng reguliert, sondern auch mit anderen zellulären Ereignissen wie Transkription und DNA-Reparatur koordiniert . Darüber hinaus weisen Ursprungssequenzen in allen Königreichen üblicherweise einen hohen AT-Gehalt auf, da Wiederholungen von Adenin und Thymin leichter zu trennen sind, da ihre Basenstapelungswechselwirkungen nicht so stark sind wie die von Guanin und Cytosin.
Die DNA-Replikation ist in verschiedene Stadien unterteilt. Während der Initiation werden die Replikationsmaschinen – Replisomen genannt – bidirektional auf der DNA aufgebaut. Diese Assemblierungsorte bilden die Startstellen der DNA-Replikation oder Replikationsstartpunkte. In der Elongationsphase wandern die Replisomen mit den Replikationsgabeln in entgegengesetzte Richtungen, entwinden die DNA-Helix und synthetisieren komplementäre Tochter-DNA-Stränge unter Verwendung beider Elternstränge als Matrizen. Sobald die Replikation abgeschlossen ist, führen bestimmte Terminationsereignisse zur Disassemblierung von Replisomen. Solange das gesamte Genom vor der Zellteilung dupliziert wird, könnte man annehmen, dass die Lage der Replikationsstartstellen keine Rolle spielt; es hat sich jedoch gezeigt, dass viele Organismen bevorzugte genomische Regionen als Ursprung verwenden. Die Notwendigkeit, den Ursprungsort zu regulieren, ergibt sich wahrscheinlich aus der Notwendigkeit, die DNA-Replikation mit anderen Prozessen zu koordinieren, die auf die gemeinsame Chromatin-Matrize einwirken, um DNA-Strangbrüche und DNA-Schäden zu vermeiden.
Replikon-Modell
Vor mehr als fünf Jahrzehnten schlugen Jacob , Brenner und Cuzin die Replikon-Hypothese vor, um die Regulation der chromosomalen DNA-Synthese in E. coli zu erklären . Das Modell postuliert, dass ein diffundierbarer, trans- wirkender Faktor, ein sogenannter Initiator, mit einem cis- wirkenden RNA-Element, dem Replikator, interagiert , um den Replikationsbeginn an einem nahegelegenen Ursprung zu fördern. Einmal an Replikatoren gebunden, lagern Initiatoren (oft mit Hilfe von Co-Loader-Proteinen) replikative Helikasen auf der DNA ab, die anschließend die Rekrutierung zusätzlicher Replisomenkomponenten und den Zusammenbau der gesamten Replikationsmaschinerie vorantreiben. Der Replikator spezifiziert dabei den Ort von Replikationsinitiationsereignissen, und die Chromosomenregion, die von einem einzelnen Ursprung oder Initiationsereignis repliziert wird, wird als Replikon definiert.
Ein grundlegendes Merkmal der Replikon-Hypothese ist, dass sie auf positiver Regulation beruht, um den Beginn der DNA-Replikation zu kontrollieren, was viele experimentelle Beobachtungen in Bakterien- und Phagensystemen erklären kann. Zum Beispiel erklärt es das Versagen extrachromosomaler DNAs ohne Ursprung, sich zu replizieren, wenn sie in Wirtszellen eingeführt werden. Es erklärt weiter Plasmid-Inkompatibilitäten in E. coli, bei denen bestimmte Plasmide die Vererbung des anderen aufgrund der Konkurrenz um die gleiche molekulare Initiationsmaschinerie destabilisieren. Ein Modell der negativen Regulation (analog zum Replikon-Operator-Modell für die Transkription) kann dagegen die obigen Befunde nicht erklären. Nichtsdestotrotz hat die Forschung nach Jacobs, Brenners und Cuzins Vorschlag des Replikonsmodells viele zusätzliche Ebenen der Replikationskontrolle in Bakterien und Eukaryoten entdeckt, die sowohl positive als auch negative regulatorische Elemente umfassen, was sowohl die Komplexität als auch die Bedeutung der zeitlichen und räumlichen Einschränkung der DNA-Replikation hervorhebt. .
Das Konzept des Replikators als genetische Einheit hat sich bei der Suche nach Replikator-DNA-Sequenzen und Initiatorproteinen in Prokaryoten und teilweise auch in Eukaryoten als sehr nützlich erwiesen , obwohl sich die Organisation und Komplexität der Replikatoren zwischen den Lebensbereichen erheblich unterscheiden. Während bakterielle Genome typischerweise einen einzelnen Replikator enthalten, der durch Konsensus-DNA-Sequenzelemente spezifiziert ist und die Replikation des gesamten Chromosoms kontrolliert, sind die meisten eukaryotischen Replikatoren – mit Ausnahme von knospender Hefe – nicht auf der Ebene der DNA-Sequenz definiert; stattdessen scheinen sie kombinatorisch durch lokale DNA-Struktur- und Chromatin- Hinweise spezifiziert zu werden . Eukaryotische Chromosomen sind auch viel größer als ihre bakteriellen Gegenstücke, was die Notwendigkeit erhöht, die DNA-Synthese von vielen Ursprüngen gleichzeitig zu initiieren, um eine rechtzeitige Replikation des gesamten Genoms zu gewährleisten. Außerdem werden viel mehr replikative Helikasen geladen als aktiviert, um die Replikation in einem gegebenen Zellzyklus zu initiieren. Die kontextgesteuerte Definition von Replikatoren und die Auswahl der Ursprünge legt ein entspanntes Replikonmodell in eukaryotischen Systemen nahe, das Flexibilität im DNA-Replikationsprogramm ermöglicht. Obwohl Replikatoren und Ursprünge auf den Chromosomen physikalisch beabstandet sein können, befinden sie sich häufig gemeinsam oder in unmittelbarer Nähe; der Einfachheit halber werden wir daher beide Elemente in dieser Übersicht als „Ursprünge“ bezeichnen. Zusammengenommen stellt die Entdeckung und Isolierung von Ursprungssequenzen in verschiedenen Organismen einen bedeutenden Meilenstein auf dem Weg zum mechanistischen Verständnis der Replikationseinleitung dar. Darüber hinaus hatten diese Errungenschaften tiefgreifende biotechnologische Auswirkungen auf die Entwicklung von Shuttle-Vektoren, die in Bakterien-, Hefe- und Säugerzellen vermehrt werden können.
Bakterien
Die meisten bakteriellen Chromosomen sind kreisförmig und enthalten einen einzigen Ursprung der chromosomalen Replikation ( oriC ). Bakterielle oriC- Regionen sind überraschend unterschiedlich in Größe (im Bereich von 250 bp bis 2 kbp), Sequenz und Organisation; dennoch hängt ihre Fähigkeit, den Beginn der Replikation zu steuern, typischerweise vom sequenzspezifischen Auslesen von Konsensus-DNA-Elementen durch den bakteriellen Initiator, ein Protein namens DnaA, ab. Ursprünge in Bakterien sind entweder kontinuierlich oder zweiteilig und enthalten drei funktionelle Elemente, die die Ursprungsaktivität kontrollieren: konservierte DNA-Wiederholungen, die spezifisch von DnaA erkannt werden (sogenannte DnaA-Boxen), ein AT-reiches DNA- Entwindungselement (DUE ) und Bindungsstellen für Proteine die helfen, die Replikationsinitiation zu regulieren. Interaktionen von DnaA sowohl mit den doppelsträngigen (ds) DnaA-Box-Regionen als auch mit einzelsträngiger (ss) DNA im DUE sind für die Ursprungsaktivierung wichtig und werden durch verschiedene Domänen im Initiatorprotein vermittelt: eine Helix-Turn-Helix (HTH) DNA-Bindungselement bzw. eine ATPase, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten ( AAA+ ) assoziiert ist . Während die Sequenz, Anzahl und Anordnung von Ursprungs-assoziierten DnaA-Boxen im gesamten Bakterienreich variieren, sind ihre spezifische Positionierung und Abstände in einer bestimmten Spezies entscheidend für die oriC- Funktion und für die Bildung produktiver Initiationskomplexe.
Unter Bakterien ist E. coli ein besonders leistungsfähiges Modellsystem, um die Organisation, Erkennung und Aktivierungsmechanismen von Replikationsursprüngen zu untersuchen. E. coli oriC umfasst eine etwa 260 bp große Region, die vier Typen von Initiatorbindungselementen enthält, die sich in ihren Affinitäten für DnaA und ihren Abhängigkeiten vom Cofaktor ATP unterscheiden . Die DnaA-Boxen R1, R2 und R4 stellen hochaffine Stellen dar, die von der HTH-Domäne von DnaA unabhängig vom Nukleotidbindungszustand des Initiators gebunden werden. Im Gegensatz dazu sind die I-, τ- und C-Stellen, die zwischen den R-Stellen verstreut sind, DnaA-Boxen mit niedriger Affinität und assoziieren bevorzugt mit ATP-gebundener DnaA, obwohl ADP-DnaA unter bestimmten Bedingungen ATP-DnaA ersetzen kann Bedingungen. Die Bindung der HTH-Domänen an die DnaA-Erkennungselemente mit hoher und niedriger Affinität fördert die ATP-abhängige Oligomerisierung höherer Ordnung der AAA+-Module von DnaA zu einem rechtshändigen Filament, das Duplex-DNA um seine äußere Oberfläche wickelt und dadurch eine superhelikale Torsion erzeugt, die das Schmelzen erleichtert des benachbarten AT-reichen DUE. Die DNA-Strangtrennung wird zusätzlich durch direkte Interaktionen der AAA+ ATPase-Domäne von DnaA mit Triplett-Repeats, sogenannten DnaA-Trios, in der proximalen DUE-Region unterstützt. Der Eingriff einzelsträngiger Trinukleotidsegmente durch das Initiatorfilament dehnt die DNA und stabilisiert die Initiationsblase, indem ein Reannealing verhindert wird. Das Ursprungselement des DnaA-Trios ist in vielen Bakterienarten konserviert, was darauf hindeutet, dass es ein Schlüsselelement für die Ursprungsfunktion ist. Nach dem Schmelzen bietet das DUE eine Eintrittsstelle für die replikative Helikase DnaB aus E. coli , die durch ihr Ladeprotein DnaC auf jedem der DNA-Einzelstränge abgelagert wird.
Obwohl die verschiedenen DNA - Aktivitäten von DnaA Bindung haben biochemisch intensiv untersucht worden , und verschiedene apo , ssDNA- oder dsDNA-gebundene Strukturen bestimmt worden sind, die genaue Architektur der höheren Ordnung DnaA- oriC bleibt Einleitung Montag unklar. Zwei Modelle wurden vorgeschlagen, um die Organisation von essentiellen Ursprungselementen und das DnaA-vermittelte oriC- Schmelzen zu erklären . Das Zweizustandsmodell geht von einem kontinuierlichen DnaA-Filament aus, das im DUE (dem Schmelzkomplex) von einem dsDNA-Bindungsmodus (dem organisierenden Komplex) zu einem ssDNA-Bindungsmodus wechselt. Im Gegensatz dazu wird die DNA im Loop-Back-Modell in oriC stark gebogen und faltet sich auf das Initiatorfilament zurück, so dass DnaA- Protomer gleichzeitig doppel- und einzelsträngige DNA-Regionen angreifen . Die Aufklärung der genauen Organisation der oriC- DNA durch DNAA bleibt daher eine wichtige Aufgabe für zukünftige Studien. Einblicke in die Architektur des Initiationskomplexes helfen nicht nur zu erklären, wie die Ursprungs-DNA geschmolzen wird, sondern auch, wie eine replikative Helikase gerichtet auf jeden der exponierten DNA-Einzelstränge im abgewickelten DUE geladen wird und wie diese Ereignisse durch Wechselwirkungen der Helikase mit unterstützt werden die Initiator- und spezifischen Ladeproteine.
Archaeen
Die Replikationsursprünge der Archaeen weisen einige, aber nicht alle organisatorischen Merkmale von bakteriellem oriC auf . Im Gegensatz zu Bakterien initiieren Archaeen oft die Replikation von mehreren Ursprüngen pro Chromosom (ein bis vier wurden berichtet); Archaeen-Ursprünge tragen jedoch auch spezialisierte Sequenzregionen, die die Ursprungsfunktion kontrollieren. Diese Elemente umfassen sowohl DNA-sequenzspezifische Ursprungserkennungsboxen (ORBs oder miniORBs) als auch ein AT-reiches DUE, das von einer oder mehreren ORB-Regionen flankiert wird. ORB-Elemente weisen hinsichtlich ihrer Anzahl, Anordnung und Abfolge eine beträchtliche Vielfalt auf, sowohl zwischen verschiedenen Archaeen-Arten als auch zwischen verschiedenen Ursprüngen innerhalb einer einzigen Art. Ein zusätzlicher Grad an Komplexität wird durch den Initiator Orc1/Cdc6 in Archaeen eingeführt, der an ORB-Regionen bindet. Archaeengenome kodieren typischerweise mehrere Paraloge von Orc1/Cdc6, die sich in ihren Affinitäten für verschiedene ORB-Elemente erheblich unterscheiden und die unterschiedlich zu den Ursprungsaktivitäten beitragen. In Sulfolobus solfataricus beispielsweise wurden drei chromosomale Ursprünge kartiert (oriC1, oriC2 und oriC3), und biochemische Studien haben komplexe Bindungsmuster von Initiatoren an diesen Stellen gezeigt. Der verwandte Initiator für oriC1 ist Orc1-1, das an diesem Ursprung mit mehreren ORBs assoziiert. OriC2 und oriC3 werden sowohl von Orc1-1 als auch von Orc1-3 gebunden. Umgekehrt spurt ein dritter Paralog, Orc1-2, an allen drei Ursprüngen vor, es wurde jedoch postuliert, dass er die Replikationseinleitung negativ reguliert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das WhiP-Protein, ein Initiator, der nicht mit Orc1/Cdc6 verwandt ist, ebenfalls alle Ursprünge bindet und die Ursprungsaktivität von oriC3 im eng verwandten Sulfolobus islandicus antreibt . Da archaeale Ursprünge oft mehrere benachbarte ORB-Elemente enthalten, können mehrere Orc1/Cdc6-Paraloge gleichzeitig zu einem Ursprung rekrutiert werden und in einigen Fällen oligomerisieren; im Gegensatz zu bakterieller DNA scheint die Bildung einer Initiatoranordnung höherer Ordnung jedoch keine allgemeine Voraussetzung für die Ursprungsfunktion in der Archaeendomäne zu sein.
Strukturstudien haben Erkenntnisse darüber geliefert, wie das archaische Orc1/Cdc6 ORB-Elemente erkennt und die Ursprungs-DNA umgestaltet. Orc1/Cdc6-Paraloge sind Zwei-Domänen-Proteine und bestehen aus einem AAA+ ATPase-Modul, das an eine C-terminale Flügelhelix-Falte fusioniert ist. DNA-komplexierte Strukturen von Orc1/Cdc6 zeigten, dass ORBs von einem Orc1/Cdc6-Monomer trotz des Vorhandenseins invertierter Wiederholungssequenzen innerhalb von ORB-Elementen gebunden werden. Sowohl die ATPase- als auch die Flügelhelix-Region interagieren mit dem DNA-Duplex, kontaktieren jedoch asymmetrisch die palindromische ORB-Wiederholungssequenz, die Orc1/Cdc6 in einer spezifischen Richtung auf der Wiederholung ausrichtet. Interessanterweise haben die DUE-flankierenden ORB- oder miniORB-Elemente oft entgegengesetzte Polaritäten, was voraussagt, dass die AAA+-Lid-Subdomänen und die geflügelten Helixdomänen von Orc1/Cdc6 auf beiden Seiten des DUE so positioniert sind, dass sie sich gegenüberstehen. Da beide Regionen von Orc1/Cdc6 mit einer replikativen Helikase der Minichromosomenerhaltung (MCM) assoziieren, ist diese spezifische Anordnung von ORB-Elementen und Orc1/Cdc6 wahrscheinlich wichtig, um zwei MCM-Komplexe symmetrisch auf das DUE zu laden. Während die ORB-DNA-Sequenz die Richtung der Orc1/Cdc6-Bindung bestimmt, stellt der Initiator überraschenderweise relativ wenige sequenzspezifische Kontakte mit DNA her. Orc1/Cdc6 unterwindet und verbiegt die DNA jedoch stark, was darauf hindeutet, dass es auf einer Mischung aus DNA-Sequenz und kontextabhängigen DNA-Strukturmerkmalen beruht, um den Ursprung zu erkennen. Bemerkenswert ist, dass die Basenpaarung im verzerrten DNA-Duplex nach Orc1/Cdc6-Bindung in den Kristallstrukturen aufrechterhalten wird, während biochemische Studien widersprüchliche Ergebnisse erbracht haben, ob archaeale Initiatoren DNA ähnlich wie bakterielle DnaA schmelzen können. Obwohl die evolutionäre Verwandtschaft von archaealen und eukaryotischen Initiatoren und replikativen Helikasen darauf hindeutet, dass archaeale MCM wahrscheinlich auf Duplex-DNA geladen wird (siehe nächster Abschnitt), können die zeitliche Reihenfolge des Ursprungsschmelzens und der Helikasebeladung sowie der Mechanismus für das Ursprungs-DNA-Schmelzen in archaealen Systeme müssen daher noch eindeutig festgelegt werden. Ebenso muss in zukünftigen Studien untersucht werden, wie genau die MCM-Helikase auf die DNA geladen wird.
Eukaryoten
Ursprungsorganisation, Spezifikation und Aktivierung in Eukaryoten sind komplexer als in bakteriellen oder archaealen Domänen und weichen deutlich von dem Paradigma ab, das für die prokaryontische Replikation initiiert wurde. Die großen Genomgrößen eukaryontischer Zellen, die von 12 Mbp bei S. cerevisiae bis 3 Gbp beim Menschen reichen , machen es erforderlich, dass die DNA-Replikation bei mehreren hundert (in knospenden Hefen) bis zu zehntausenden (beim Menschen) Ursprüngen beginnt, um die DNA-Replikation von alle Chromosomen während jedes Zellzyklus. Mit Ausnahme von S. cerevisiae und verwandten Saccharomycotina- Arten enthalten eukaryotische Ursprünge keine Konsensus-DNA-Sequenzelemente, aber ihre Lage wird durch kontextuelle Hinweise wie lokale DNA-Topologie, DNA-Strukturmerkmale und Chromatinumgebung beeinflusst. Nichtsdestotrotz beruht die eukaryotische Ursprungsfunktion immer noch auf einem konservierten Initiatorproteinkomplex, um während der späten M- und G1- Phasen des Zellzyklus replikative Helikasen auf die DNA zu laden , ein Schritt, der als Ursprungslizenzierung bekannt ist. Im Gegensatz zu ihrem Pendants Bakterien wird replikativen Helikasen in Eukaryonten geladen auf Duplex - DNA - Ursprung in einer inaktiven, doppel hexameren Form , und nur eine Untergruppe von ihnen (10-20% in Säugerzellen) während jeder gegebenen aktiviert wird , die S - Phase , Ereignisse, werden als Ursprungsfeuerung bezeichnet. Der Ort aktiver eukaryotischer Ursprünge wird daher auf mindestens zwei verschiedenen Ebenen bestimmt, der Ursprungslizenzierung, um alle potentiellen Ursprünge zu markieren, und der Ursprungsfeuerung, um eine Untergruppe auszuwählen, die den Zusammenbau der Replikationsmaschinerie und die Initiierung der DNA-Synthese ermöglicht. Die zusätzlich lizenzierten Ursprünge dienen als Backup und werden nur aktiviert, wenn nahegelegene Replikationsgabeln verlangsamt oder blockiert werden, um sicherzustellen, dass die DNA-Replikation abgeschlossen werden kann, wenn Zellen unter Replikationsstress geraten. Zusammen verkörpern der Überschuss an lizenzierten Ursprüngen und die strenge Kontrolle des Zellzyklus von Ursprungslizenzierung und -feuerung zwei wichtige Strategien, um Unter- und Überreplikation zu verhindern und die Integrität eukaryontischer Genome zu erhalten.
Frühe Studien an S. cerevisiae deuteten darauf hin, dass Replikationsursprünge in Eukaryoten auf DNA-sequenzspezifische Weise analog zu denen in Prokaryoten erkannt werden könnten. In knospenden Hefen führte die Suche nach genetischen Replikatoren zur Identifizierung von autonom replizierenden Sequenzen (ARS), die eine effiziente DNA-Replikationsinitiation extrachromosomaler DNA unterstützen. Diese ARS-Regionen sind ungefähr 100-200 bp lang und weisen eine mehrteilige Organisation auf, die A-, B1-, B2- und manchmal B3-Elemente enthält, die zusammen für die Ursprungsfunktion essentiell sind. Das A-Element umfasst die konservierte 11 bp ARS-Konsensussequenz (ACS), die zusammen mit dem B1-Element die primäre Bindungsstelle für den Heterohexameric Origin Recognition Complex (ORC), den eukaryotischen Replikationsinitiator, darstellt. Innerhalb von ORC basieren fünf Untereinheiten auf konservierter AAA+ ATPase und geflügelten Helixfalten und ordnen sich zu einem pentameren Ring an, der die DNA umgibt. In knospenden Hefe-ORC sind DNA-bindende Elemente in den ATPase- und Flügelhelix-Domänen sowie angrenzende basische Patch-Regionen in einigen der ORC-Untereinheiten in der zentralen Pore des ORC-Rings so positioniert, dass sie die DNA-Sequenz unterstützen. spezifische Erkennung des ACS in einer ATP-abhängigen Weise. Im Gegensatz dazu sind die Rollen der B2- und B3-Elemente weniger klar. Die B2-Region ist der ACS in der Sequenz ähnlich und es wurde vorgeschlagen, dass sie unter bestimmten Bedingungen als zweite ORC-Bindungsstelle oder als Bindungsstelle für den replikativen Helikase-Kern fungiert. Umgekehrt rekrutiert das B3-Element den Transkriptionsfaktor Abf1, obwohl B3 bei allen knospenden Hefe-Ursprüngen nicht gefunden wird und die Abf1-Bindung für die Ursprungsfunktion nicht unbedingt essentiell zu sein scheint.
Die Ursprungserkennung in anderen Eukaryoten als S. cerevisiae oder seinen nahen Verwandten entspricht nicht dem sequenzspezifischen Auslesen von konservierten Ursprungs-DNA-Elementen. Versuche, spezifische chromosomale Replikatorsequenzen allgemeiner in eukaryontischen Spezies zu isolieren, entweder genetisch oder durch genomweite Kartierung von Initiatorbindungs- oder Replikationsstartstellen, haben keine klaren Konsensussequenzen am Ursprung identifiziert. Somit bedeuten sequenzspezifische DNA-Initiator-Wechselwirkungen in knospenden Hefen eher einen spezialisierten Modus für die Ursprungserkennung in diesem System als einen archetypischen Modus für die Ursprungsspezifikation über die eukaryotische Domäne hinweg. Nichtsdestotrotz beginnt die DNA-Replikation an diskreten Stellen, die nicht zufällig über eukaryotische Genome verteilt sind, was argumentiert, dass alternative Mittel die chromosomale Ursprungsstelle in diesen Systemen bestimmen. Diese Mechanismen beinhalten ein komplexes Zusammenspiel zwischen DNA-Zugänglichkeit, Nukleotidsequenz-Schiefe (sowohl AT-Reichtum als auch CpG-Inseln wurden mit Ursprüngen in Verbindung gebracht), Nukleosomenpositionierung , epigenetischen Merkmalen, DNA-Topologie und bestimmten DNA-Strukturmerkmalen (z. B. G4-Motive) als regulatorische Proteine und Transkriptionsinterferenz. Wichtig ist, dass die Ursprungseigenschaften nicht nur zwischen verschiedenen Ursprüngen in einem Organismus und zwischen Arten variieren, sondern sich einige auch während der Entwicklung und Zelldifferenzierung ändern können. Der Chorion-Locus in Drosophila- Follikelzellen ist ein gut etabliertes Beispiel für die räumliche und entwicklungsbezogene Kontrolle von Initiationsereignissen. Diese Region erfährt in einem definierten Stadium während der Oogenese eine DNA-replikationsabhängige Genamplifikation und beruht auf der rechtzeitigen und spezifischen Aktivierung von Chorion-Ursprüngen, die wiederum durch Ursprungs-spezifische cis-Elemente und mehrere Proteinfaktoren, einschließlich des Myb-Komplexes, reguliert wird. E2F1 und E2F2. Diese kombinatorische Spezifikation und multifaktorielle Regulation von Metazoen-Ursprüngen hat die Identifizierung von einigenden Merkmalen erschwert, die die Position von Replikationsstartstellen in Eukaryoten allgemeiner bestimmen.
Um die Replikationsinitiation und die Ursprungserkennung zu erleichtern, haben ORC-Assemblies von verschiedenen Spezies spezialisierte Hilfsdomänen entwickelt, von denen angenommen wird, dass sie das Initiator-Targeting zu chromosomalen Ursprüngen oder Chromosomen im Allgemeinen unterstützen. Zum Beispiel enthält die Orc4-Untereinheit in S. pombe ORC mehrere AT-Hooks, die vorzugsweise AT-reiche DNA binden, während im metazoischen ORC der TFIIB-ähnlichen Domäne von Orc6 eine ähnliche Funktion zugeschrieben wird. Metazoische Orc1-Proteine beherbergen auch eine Brom-adjacent Homology (BAH)-Domäne, die mit H4K20me2-Nukleosomen interagiert. Insbesondere in Säugerzellen wurde berichtet, dass die H4K20-Methylierung für eine effiziente Replikationsinitiation erforderlich ist, und die Orc1-BAH-Domäne erleichtert die ORC-Assoziation mit Chromosomen und die vom Ursprung des Epstein-Barr-Virus abhängige Replikation. Daher ist es faszinierend zu spekulieren, dass beide Beobachtungen zumindest in einer Untergruppe von Metazoen mechanistisch verknüpft sind, aber diese Möglichkeit muss in zukünftigen Studien weiter untersucht werden. Neben der Erkennung bestimmter DNA- oder epigenetischer Merkmale assoziiert ORC auch direkt oder indirekt mit mehreren Partnerproteinen, die die Rekrutierung von Initiatoren unterstützen könnten, darunter LRWD1, PHIP (oder DCAF14), HMGA1a und andere. Interessanterweise beugt Drosophila ORC, wie sein Gegenstück aus der Hefe, die DNA, und es wurde berichtet, dass negatives Supercoiling die DNA-Bindung dieses Komplexes verbessert, was darauf hindeutet, dass die DNA-Form und Formbarkeit die Position der ORC-Bindungsstellen in Metazoen-Genomen beeinflussen könnte. Ein molekulares Verständnis dafür, wie die DNA-Bindungsregionen von ORC das Auslesen von strukturellen Eigenschaften des DNA-Duplex in Metazoen statt spezifischer DNA-Sequenzen wie in S. cerevisiae unterstützen könnten, bedarf hochauflösender struktureller Informationen über DNA-gebundene Metazoen-Initiatoranordnungen. Ob und wie verschiedene epigenetische Faktoren zur Rekrutierung von Initiatoren in Metazoen-Systemen beitragen, ist ebenfalls unzureichend definiert und eine wichtige Frage, die genauer behandelt werden muss.
Nach der Rekrutierung zu den Ursprüngen treiben ORC und seine Co-Faktoren Cdc6 und Cdt1 die Ablagerung des Minichromosom-Erhaltungskomplexes 2-7 (Mcm2-7) auf der DNA an. Wie der archaeale replikative Helikasekern wird Mcm2-7 als Kopf-an-Kopf-Doppelhexamer auf die DNA geladen, um die Ursprünge zu lizenzieren. In der S-Phase phosphorylieren Dbf4-abhängige Kinase (DDK) und Cyclin-abhängige Kinase (CDK) mehrere Mcm2-7-Untereinheiten und zusätzliche Initiationsfaktoren, um die Rekrutierung der Helikase-Koaktivatoren Cdc45 und GINS, das DNA-Schmelzen und schließlich bidirektional zu fördern Replisome Assembly an einer Untermenge der lizenzierten Ursprünge. Sowohl in Hefe als auch in Metazoen sind die Ursprünge frei oder an Nukleosomen verarmt, eine Eigenschaft, die für die Mcm2-7-Beladung entscheidend ist. Eine permissive Chromatinumgebung ist weiterhin wichtig für die Ursprungsaktivierung und wurde mit der Regulierung sowohl der Ursprungseffizienz als auch des Zeitpunkts des Ursprungsbrennens in Verbindung gebracht. Euchromatische Ursprünge enthalten typischerweise aktive Chromatinmarkierungen, replizieren sich früh und sind effizienter als spätreplizierende, heterochromatische Ursprünge, die umgekehrt durch repressive Markierungen gekennzeichnet sind. Es überrascht nicht, dass mehrere Chromatin-Remodeler und Chromatin-modifizierende Enzyme mit Ursprüngen und bestimmten Initiationsfaktoren assoziiert sind, aber wie ihre Aktivitäten verschiedene Replikationsinitiationsereignisse beeinflussen, bleibt weitgehend unklar. Bemerkenswerterweise wurden kürzlich auch cis-wirkende „Early Replication Control Elements“ (ECREs) identifiziert, die dazu beitragen, das Replikationstiming zu regulieren und die 3D-Genomarchitektur in Säugerzellen zu beeinflussen. Das Verständnis der molekularen und biochemischen Mechanismen, die dieses komplexe Zusammenspiel zwischen 3D-Genomorganisation, lokaler und höherwertiger Chromatinstruktur und Replikationsinitiation orchestrieren, ist ein spannendes Thema für weitere Studien.
Warum haben sich die Replikationsursprünge von Metazoen von dem DNA-sequenzspezifischen Erkennungsparadigma, das die Replikationsstartstellen in Prokaryonten und knospenden Hefen bestimmt, abgewichen? Beobachtungen, dass die Ursprünge von Metazoen häufig mit Promotorregionen in Drosophila- und Säugetierzellen kolokalisieren und dass Replikations-Transkriptionskonflikte aufgrund von Kollisionen der zugrunde liegenden molekularen Maschinen zu DNA-Schäden führen können, legen nahe, dass die richtige Koordination von Transkription und Replikation für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität wichtig ist. Neuere Erkenntnisse weisen auch auf eine direktere Rolle der Transkription bei der Beeinflussung des Ursprungsorts hin, entweder durch Hemmung der Mcm2-7-Beladung oder durch Neupositionierung von beladenem Mcm2-7 auf Chromosomen. Sequenzunabhängige (aber nicht unbedingt zufällige) Initiatorbindung an DNA ermöglicht zusätzlich Flexibilität bei der Spezifizierung von Helikase-Ladestellen und bestimmt zusammen mit transkriptionaler Interferenz und der Variabilität der Aktivierungseffizienz lizenzierter Ursprünge wahrscheinlich den Ursprungsort und trägt zur Co-Regulierung von DNA-Replikations- und Transkriptionsprogramme während der Entwicklung und des Zellschicksalswechsels. Die Computermodellierung von Initiationsereignissen in S. pombe sowie die Identifizierung zelltypspezifischer und entwicklungsregulierter Ursprünge in Metazoen stimmen mit dieser Vorstellung überein. Allerdings besteht auch zwischen verschiedenen Zellen innerhalb einer Population ein hohes Maß an Flexibilität bei der Herkunftswahl, wenngleich die molekularen Mechanismen, die zu der Heterogenität der Herkunftsverwendung führen, unklar bleiben. Die Kartierung von Ursprüngen in einzelnen Zellen in Metazoen-Systemen und die Korrelation dieser Initiationsereignisse mit der Genexpression und dem Chromatinstatus einzelner Zellen wird wichtig sein, um zu klären, ob die Ursprungswahl rein stochastisch oder auf definierte Weise kontrolliert ist.
Viral
Viren besitzen oft einen einzigen Replikationsursprung.
Es wurde beschrieben, dass eine Vielzahl von Proteinen an der viralen Replikation beteiligt sind. Zum Beispiel verwenden Polyoma- Viren Wirtszellen- DNA-Polymerasen , die an einen viralen Replikationsursprung anheften, wenn das T-Antigen vorhanden ist.
Variationen
Obwohl die DNA-Replikation für die genetische Vererbung essentiell ist, sind definierte, ortsspezifische Replikationsursprünge technisch keine Voraussetzung für die Genomduplikation, solange alle Chromosomen vollständig kopiert werden, um die Genkopienzahlen zu erhalten. Bestimmte Bakteriophagen und Viren können beispielsweise die DNA-Replikation durch homologe Rekombination unabhängig von dedizierten Ursprüngen initiieren. Ebenso verwendet das Archaeon Haloferax volcanii eine rekombinationsabhängige Initiation, um sein Genom zu duplizieren, wenn seine endogenen Ursprünge gelöscht werden. Ähnliche nicht-kanonische Initiationsereignisse durch bruchinduzierte oder transkriptionsinitiierte Replikation wurden bei E. coli und S. cerevisiae berichtet . Trotz der Fähigkeit von Zellen, unter diesen außergewöhnlichen Umständen die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten, ist die herkunftsabhängige Initiation eine gemeinsame Strategie, die universell in verschiedenen Lebensbereichen angewendet wird.
Darüber hinaus haben sich detaillierte Studien zur Replikationseinleitung auf eine begrenzte Anzahl von Modellsystemen konzentriert. Die ausführlich untersuchten Pilze und Metazoen sind beide Mitglieder der Opisthokont- Supergruppe und veranschaulichen nur einen kleinen Teil der evolutionären Landschaft im eukaryotischen Bereich. Vergleichsweise wenige Bemühungen wurden auf andere eukaryontische Modellsysteme wie Kinetoplastiden oder Tetrahymena gerichtet. Überraschenderweise haben diese Studien interessante Unterschiede sowohl in den Herkunftseigenschaften als auch in der Initiatorzusammensetzung im Vergleich zu Hefe und Metazoen aufgezeigt.
Siehe auch
Verweise
Dieser Artikel wurde von der folgenden Quelle unter einer CC BY 4.0- Lizenz ( 2019 ) angepasst ( Berichte von Gutachtern ):
Babatunde Ekundayo; Franziska Bleichert (12.09.2019). "Ursprünge der DNA-Replikation" . PLOS-Genetik . 15 (9): e1008320. doi : 10.1371/JOURNAL.PGEN.1008320 . ISSN 1553-7390 . PMC 6742236 . PMID 31513569 . Wikidata Q86320168 .
Weiterlesen
- Lewin B (2004). Gene VIII . Lehrlingssaal. ISBN 978-0-13-144945-9.
Externe Links
- Ori-Finder, eine Online-Software zur Vorhersage von bakteriellen und archaealen oriC s
- Replikation+Ursprung in der US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)