Fusion der Lipiddoppelschicht - Lipid bilayer fusion
In der Membranbiologie ist Fusion der Prozess, bei dem zwei ursprünglich verschiedene Lipiddoppelschichten ihre hydrophoben Kerne verschmelzen , was zu einer miteinander verbundenen Struktur führt. Wenn diese Fusion durch beide Segel beider Doppelschichten vollständig verläuft, wird eine wässrige Brücke gebildet und der innere Inhalt der beiden Strukturen kann sich vermischen. Alternativ, wenn nur ein Segel von jeder Doppelschicht an dem Fusionsprozess beteiligt ist, werden die Doppelschichten als hemifusioniert bezeichnet. Bei der Hemifusion können sich die Lipidbestandteile des äußeren Segels der beiden Doppelschichten vermischen, aber die inneren Segel bleiben getrennt. Der von jeder Doppelschicht eingeschlossene wässrige Inhalt bleibt ebenfalls getrennt.
Fusion ist an vielen zellulären Prozessen beteiligt, insbesondere bei Eukaryoten, da die eukaryotische Zelle weitgehend durch Lipiddoppelschichtmembranen unterteilt ist. Exozytose , Befruchtung einer Eizelle durch Spermien und Transport von Abfallprodukten zum Lysosom sind einige der vielen eukaryotischen Prozesse, die auf einer Form der Fusion beruhen. Die Fusion ist auch ein wichtiger Mechanismus für den Transport von Lipiden von ihrem Syntheseort zur Membran, wo sie benötigt werden. Sogar der Eintritt von Krankheitserregern kann durch Fusion gesteuert werden, da viele doppelschichtige Viren spezielle Fusionsproteine besitzen, um in die Wirtszelle einzudringen.
Lipidmechanismus
Es gibt vier grundlegende Schritte im Fusionsprozess, obwohl jeder dieser Schritte tatsächlich eine komplexe Abfolge von Ereignissen darstellt. Zunächst müssen die beteiligten Membranen aggregieren und sich bis auf wenige Nanometer annähern. Zweitens müssen die beiden Doppelschichten in sehr engen Kontakt kommen (innerhalb weniger Angström). Um diesen engen Kontakt zu erreichen, müssen die beiden Oberflächen zumindest teilweise entwässert werden, da das normalerweise vorhandene gebundene Oberflächenwasser dazu führt, dass sich Doppelschichten in dieser Entfernung stark abstoßen. Drittens muss sich an einem Punkt zwischen den beiden Doppelschichten eine Destabilisierung entwickeln, die eine stark lokalisierte Umlagerung der beiden Doppelschichten induziert. Schließlich, wenn dieser Punktdefekt wächst, vermischen sich die Komponenten der beiden Doppelschichten und diffundieren von der Kontaktstelle weg. Je nachdem, ob eine Hemifusion oder eine vollständige Fusion auftritt, kann sich auch der innere Inhalt der Membranen an dieser Stelle vermischen.
Die genauen Mechanismen hinter dieser komplexen Abfolge von Ereignissen sind noch immer umstritten. Um das System zu vereinfachen und eine genauere Untersuchung zu ermöglichen, wurden viele Experimente in vitro mit synthetischen Lipidvesikeln durchgeführt. Diese Studien haben gezeigt, dass zweiwertige Kationen eine entscheidende Rolle im Fusionsprozess spielen, indem sie an negativ geladene Lipide wie Phosphatidylserin , Phosphatidylglycerin und Cardiolipin binden . Eine Rolle dieser Ionen im Fusionsprozess besteht darin, die negative Ladung auf der Oberfläche der Doppelschicht abzuschirmen, die elektrostatische Abstoßung zu verringern und die Annäherung der Membranen aneinander zu ermöglichen. Dies ist jedoch eindeutig nicht die einzige Rolle, da es einen ausführlich dokumentierten Unterschied in der Fähigkeit von Mg 2+ gegenüber Ca 2+ gibt , eine Fusion zu induzieren. Obwohl Mg 2+ eine ausgedehnte Aggregation induziert, induziert es keine Fusion, während Ca 2+ beides induziert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Diskrepanz auf einen unterschiedlichen Grad der Dehydratation zurückzuführen ist. Nach dieser Theorie binden Calciumionen stärker an geladene Lipide, aber weniger stark an Wasser. Die resultierende Verdrängung von Calcium durch Wasser destabilisiert die Lipid-Wasser-Grenzfläche und fördert den engen Kontakt zwischen den Doppelschichten. Eine kürzlich vorgeschlagene Alternativhypothese ist, dass die Bindung von Calcium eine destabilisierende seitliche Spannung induziert . Was auch immer der Mechanismus der Calcium-induzierten Fusion ist, die anfängliche Wechselwirkung ist eindeutig elektrostatisch, da zwitterionische Lipide für diesen Effekt nicht anfällig sind.
Beim Fusionsprozess ist die Lipidkopfgruppe nicht nur an der Ladungsdichte beteiligt, sondern kann auch die Dehydratation und die Defektnukleation beeinflussen. Diese Effekte sind unabhängig von der Wirkung von Ionen. Die Anwesenheit der ungeladenen Kopfgruppe Phosphatidylethanolamin (PE) erhöht die Fusion, wenn sie in eine Phosphatidylcholin-Doppelschicht eingebaut wird. Dieses Phänomen wurde von einigen als Dehydrationseffekt ähnlich dem Einfluss von Kalzium erklärt. Die PE-Kopfgruppe bindet Wasser weniger fest als PC und kann daher leichter eine enge Anlagerung ermöglichen. Eine alternative Erklärung ist, dass die physikalische und nicht die chemische Natur von PE dazu beitragen kann, eine Fusion zu induzieren. Nach der Stiel-Hypothese der Fusion muss sich zwischen den beiden Doppelschichten eine stark gekrümmte Brücke bilden, damit eine Fusion stattfindet. Da PE eine kleine Kopfgruppe hat und leicht invertierte Micellenphasen bildet , sollte es nach dem Stielmodell die Bildung dieser Stiele fördern. Ein weiterer Beweis für diese Theorie ist die Tatsache, dass gezeigt wurde, dass bestimmte Lipidgemische die Fusion nur unterstützen, wenn sie über die Übergangstemperatur dieser invertierten Phasen erhöht werden. Auch dieses Thema bleibt umstritten, und selbst wenn im Fusionsprozess eine gekrümmte Struktur vorliegt, wird in der Literatur darüber diskutiert, ob es sich um eine kubische, hexagonale oder exotischere verlängerte Phase handelt.
Fusionsproteine
Die Situation wird noch komplizierter, wenn man eine Fusion in vivo betrachtet, da die biologische Fusion fast immer durch die Wirkung membranassoziierter Proteine reguliert wird . Die ersten dieser Proteine, die untersucht wurden, waren die viralen Fusionsproteine, die es einem umhüllten Virus ermöglichen, sein genetisches Material in die Wirtszelle einzubringen (behüllte Viren sind solche, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind; einige andere haben nur eine Proteinhülle). Im Großen und Ganzen gibt es zwei Klassen von viralen Fusionsproteinen: sauer und pH-unabhängig. pH- unabhängige Fusionsproteine können unter neutralen Bedingungen funktionieren und mit der Plasmamembran fusionieren , wodurch ein Viruseintritt in die Zelle ermöglicht wird. Zu den Viren, die dieses Schema nutzten, gehörten HIV , Masern und Herpes . Saure Fusionsproteine, wie sie bei Influenza vorkommen, werden nur im niedrigen pH-Wert saurer Endosomen aktiviert und müssen zunächst endozytiert werden , um in die Zelle eindringen zu können.
Eukaryotische Zellen verwenden völlig unterschiedliche Klassen von Fusionsproteinen, von denen die am besten untersuchten die SNAREs sind . SNARE-Proteine werden verwendet, um den gesamten vesikulären intrazellulären Verkehr zu steuern. Trotz jahrelanger Studien ist noch vieles über die Funktion dieser Proteinklasse unbekannt. Tatsächlich gibt es immer noch eine aktive Debatte darüber, ob SNAREs mit dem frühen Andocken verbunden sind oder später am Fusionsprozess teilnehmen, indem sie die Hemifusion erleichtern. Selbst wenn die Rolle von SNAREs oder anderen spezifischen Proteinen beleuchtet ist, ist ein einheitliches Verständnis von Fusionsproteinen unwahrscheinlich, da es innerhalb dieser Klassen eine enorme Vielfalt an Struktur und Funktion gibt und nur sehr wenige Themen erhalten bleiben.
Fusion in der Laborpraxis
In Studien der Molekular- und Zellbiologie ist es oft wünschenswert, eine Fusion künstlich zu induzieren. Obwohl dies mit der oben diskutierten Zugabe von Calcium erreicht werden kann, ist dieses Verfahren oft nicht durchführbar, da Calcium viele andere biochemische Prozesse reguliert und seine Zugabe ein starkes Problem wäre. Außerdem induziert Calcium, wie erwähnt, eine massive Aggregation sowie eine Fusion. Die Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) bewirkt eine Fusion ohne signifikante Aggregation oder biochemische Zerstörung. Dieses Verfahren wird heute in großem Umfang angewendet, beispielsweise durch die Fusion von B-Zellen mit Myelomzellen . Das resultierende „ Hybridom “ aus dieser Kombination exprimiert einen gewünschten Antikörper, wie durch die beteiligte B-Zelle bestimmt, wird aber aufgrund der Myelomkomponente immortalisiert. Der Mechanismus der PEG-Fusion ist nicht endgültig identifiziert, aber einige Forscher glauben, dass das PEG durch die Bindung einer großen Anzahl von Wassermolekülen die chemische Aktivität des Wassers effektiv verringert und somit die Lipid-Kopfgruppen dehydriert. Die Fusion kann auch künstlich durch Elektroporation in einem als Elektrofusion bekannten Prozess induziert werden . Es wird angenommen, dass dieses Phänomen auf die während der Elektroporation gebildeten energetisch aktiven Kanten zurückzuführen ist , die als lokaler Defektpunkt für das Keimwachstum des Stiels zwischen zwei Doppelschichten dienen können.
Alternativ können SNARE-inspirierte Modellsysteme verwendet werden, um die Membranfusion von Lipidvesikeln zu induzieren. In diesen Systemen "zipfeln" membranverankerte komplementäre DNA, PNA, Peptide oder andere Moleküle zusammen und ziehen die Membranen in die Nähe. Solche Systeme könnten in Zukunft praktische Anwendungen haben, beispielsweise bei der Wirkstoffabgabe. Das wahrscheinlich am besten untersuchte System besteht aus Coiled-Coil-bildenden Peptiden mit komplementärer Ladung (eines trägt typischerweise einen Überschuss an positiv geladenen Lysinen und wird daher als Peptid K bezeichnet, und eins negativ geladene Glutaminsäuren wird als Peptid E bezeichnet). Interessanterweise wurde entdeckt, dass nicht nur die Coiled-Coil-Bildung zwischen den beiden Peptiden für die Membranfusion notwendig ist, sondern auch, dass das Peptid K mit der Membranoberfläche wechselwirkt und lokale Defekte verursacht.
Assays zur Messung der Membranfusion
Es gibt zwei Fusionsstufen: Mischen von Membranlipiden und Mischen des Inhalts. Assays der Membranfusion berichten entweder über das Mischen von Membranlipiden oder das Mischen des wässrigen Inhalts der fusionierten Einheiten.
Assays zur Messung der Lipidmischung
Assays, die das Mischen von Lipiden bewerten, nutzen konzentrationsabhängige Effekte wie nicht-strahlende Energieübertragung, Fluoreszenzlöschung und Pyreneximer-Bildung.
- NBD-Rhodamin-Energietransfer: Bei dieser Methode verbinden sich sowohl mit NBD (Donor) als auch mit Rhodamin (Akzeptor) markierte Membranen mit unmarkierter Membran. Wenn sich NBD und Rhodamin in einem bestimmten Abstand befinden, findet der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) statt. Nach der Fusion nimmt der Resonanzenergietransfer (FRET) ab, wenn der durchschnittliche Abstand zwischen den Sonden zunimmt, während die NBD-Fluoreszenz zunimmt.
- Pyren-Excimer-Bildung: Pyren- Monomer- und Excimer- Emissionswellenlängen sind unterschiedlich. Die Emissionswellenlänge von Monomer beträgt etwa 400 nm und die von Excimer liegt bei etwa 470 nm. Bei diesem Verfahren verbindet sich eine mit Pyren markierte Membran mit einer unmarkierten Membran. Pyren assoziiert sich selbst in der Membran und angeregtes Pyren regt dann anderes Pyren an. Vor der Fusion ist der Großteil der Emission Excimer-Emission. Nach der Fusion nimmt der Abstand zwischen den Sonden zu und das Verhältnis der Excimer-Emission nimmt ab.
- Octadecylrhodamin B Selbstlöschung: Dieser Assay basiert auf der Selbstlöschung von Octadecylrhodamin B. Die Selbstlöschung von Octadecylrhodamin B tritt auf, wenn die Sonde in Membranlipiden in Konzentrationen von 1–10 Mol-% eingebaut wird, da Rhodamindimere die Fluoreszenz löschen. Bei diesem Verfahren verbindet sich membranmarkiertes Rhodamin mit unmarkierter Membran. Fusion mit unmarkierten Membranen führt zu einer Verdünnung der Sonde, die von einer zunehmenden Fluoreszenz begleitet wird. Das Hauptproblem dieses Assays ist der spontane Transfer.
Assays zur Messung der Inhaltsmischung
Das Mischen wässriger Inhalte aus Vesikeln als Folge von Lyse, Fusion oder physiologischer Permeabilität kann fluorometrisch unter Verwendung von niedermolekularen löslichen Tracern nachgewiesen werden.
- Fluoreszenz-Quenching-Assays mit ANTS/DPX: ANTS ist ein polyanionisches Fluorophor, während DPX ein kationischer Quencher ist. Der Assay basiert auf deren Kollisionslöschung. Separate Vesikelpopulationen werden mit ANTS bzw. DPX beladen. Wenn eine Inhaltsmischung stattfindet, kollidieren ANTS und DPX und die Fluoreszenz von ANTS, die bei 530 nm überwacht wird, mit Anregung bei 360 nm wird gelöscht. Dieses Verfahren wird bei saurem pH und hoher Konzentration durchgeführt.
- Fluoreszenzverstärkungsassays mit Tb 3+ /DPA: Diese Methode basiert auf der Tatsache, dass Chelat von Tb 3+ /DPA 10.000-mal stärker fluoresziert als Tb 3+ allein. Beim Tb 3+ /DPA-Assay werden separate Vesikelpopulationen mit TbCl 3 oder DPA beladen . Die Bildung von Tb 3+ /DPA-Chelat kann verwendet werden, um die Vesikelfusion anzuzeigen. Diese Methode ist gut für proteinfreie Membranen.
- Einzelmolekül-DNA-Assay. Eine DNA-Haarnadel bestehend aus 5 Basenpaaren Stamm und Poly-Thymidin-Schleife, die mit einem Donor (Cy3) und einem Akzeptor (Cy5) an den Enden des Stammes markiert ist, wurde in das v-SNARE-Vesikel eingekapselt. Wir haben mehrere unmarkierte Polyadenosin-DNA-Stränge separat in das t-SNARE-Vesikel eingekapselt. Wenn die beiden Vesikel mit einem Durchmesser von ~100 nm andocken und sich zwischen ihnen eine Fusionspore bildet, die groß genug ist, sollten die beiden DNA-Moleküle hybridisieren, die Stammregion der Haarnadel öffnen und die Effizienz des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) umschalten ( E) zwischen Cy3 und Cy5 von einem hohen zu einem niedrigen Wert.