SNARE (Protein) - SNARE (protein)

Molekulare Maschinerie, die die Vesikelfusion bei der Freisetzung von Neuromediatoren antreibt . Der SNARE-Kernkomplex wird von vier α-Helices gebildet, die von Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP-25 beigesteuert werden, Synaptotagmin dient als Kalziumsensor und reguliert das SNARE-Zippen eng.

SNARE-Proteine – „ SNA P RE ceptor“ – sind eine große Proteinfamilie, die aus mindestens 24 Mitgliedern in Hefen , mehr als 60 Mitgliedern in Säugerzellen und einigen Pflanzen in Pflanzen besteht. Die Hauptaufgabe von SNARE-Proteinen besteht darin, die Vesikelfusion zu vermitteln – die Fusion von Vesikel mit der Zielmembran ; dies vermittelt insbesondere die Exozytose , kann aber auch die Fusion von Vesikel mit membrangebundenen Kompartimenten (wie einem Lysosom ) vermitteln. Die am besten untersuchten SNAREs sind diejenigen, die die Neurotransmitter- Freisetzung synaptischer Vesikel in Neuronen vermitteln . Diese neuronalen SNAREs sind die Angriffspunkte der Neurotoxine, die für Botulismus und Tetanus verantwortlich sind, die von bestimmten Bakterien produziert werden .

Typen

SNAREs können in zwei Kategorien eingeteilt werden: Vesikel oder v-SNAREs , die während des Knospungsvorgangs in die Membranen von Transportvesikeln eingebaut werden, und Ziel- oder t-SNAREs , die mit Nervenendmembranen assoziiert sind. Es gibt Hinweise darauf, dass t-SNAREs stabile Subkomplexe bilden, die als Führungen für v-SNARE dienen, die in die Membran eines proteinbeschichteten Vesikels eingebaut werden und sich binden, um die Bildung des SNARE-Komplexes zu vervollständigen. Mehrere SNARE-Proteine ​​befinden sich sowohl auf Vesikeln als auch auf Zielmembranen, daher berücksichtigt ein neueres Klassifikationsschema strukturelle Merkmale von SNAREs und unterteilt sie in R-SNAREs und Q-SNAREs. Oft fungieren R-SNAREs als v-SNAREs und Q-SNAREs als t-SNAREs. R-SNAREs sind Proteine, die einen Arginin(R)-Rest zur Bildung der Nullionenschicht im zusammengesetzten Kern-SNARE-Komplex beitragen . Ein besonderes R-SNARE ist Synaptobrevin, das sich in den synaptischen Vesikeln befindet. Q-SNAREs sind Proteine, die einen Glutamin (Q)-Rest zur Bildung der Nullionenschicht im zusammengesetzten Kern-SNARE-Komplex beitragen. Q-SNAREs umfassen Syntaxin und SNAP-25. Q-SNAREs werden je nach ihrer Position im Vier-Helix-Bündel weiter als Qa-, Qb- oder Qc-SNAREs klassifiziert.

Auftreten

Varianten sind von Hefen, Säugetieren Drosophila und Caenorhabditis elegans bekannt .

Struktur

SNAREs sind kleine, reichlich vorhandene, manchmal am Schwanz verankerte Proteine, die oft posttranslational über eine C-terminale Transmembrandomäne in Membranen eingefügt werden . Sieben der 38 bekannten SNAREs, darunter SNAP-25 , haben keine Transmembrandomäne und werden stattdessen über Lipidmodifikationen wie Palmitoylierung an die Membran gebunden . Am Schwanz verankerte Proteine ​​können unter anderem in die Plasmamembran , das endoplasmatische Retikulum , Mitochondrien und Peroxisomen eingefügt werden, obwohl jedes bestimmte SNARE auf eine einzigartige Membran gerichtet ist. Das Targeting von SNAREs wird erreicht, indem entweder die Zusammensetzung der C-terminalen flankierenden Aminosäurereste oder die Länge der Transmembrandomäne verändert wird. Der Ersatz der Transmembrandomäne durch Lipidanker führt zu einem Zwischenstadium der Membranfusion, bei dem nur die beiden sich berührenden Segel verschmelzen und nicht die beiden distalen Segel der beiden Membrandoppelschichten.

Obwohl sich SNAREs in Struktur und Größe erheblich unterscheiden, teilen sie alle ein Segment in ihrer zytosolischen Domäne, das als SNARE- Motiv bezeichnet wird und aus 60-70 Aminosäuren besteht und Heptad-Wiederholungen enthält , die die Fähigkeit haben, Coiled-Coil-Strukturen zu bilden. V- und t-SNAREs können sich reversibel zu engen Vier-Helix-Bündeln zusammenfügen, die als "trans"-SNARE-Komplexe bezeichnet werden. In synaptischen Vesikeln bestehen die leicht gebildeten metastabilen "trans"-Komplexe aus drei SNAREs: Syntaxin 1 und SNAP-25, die in der Zellmembran resident sind, und Synaptobrevin (auch als vesikel-assoziiertes Membranprotein oder VAMP bezeichnet), das in der Vesikelmembran verankert ist.

Bei der neuronalen Exozytose sind Syntaxin und Synaptobrevin durch ihre C-terminalen Domänen in den jeweiligen Membranen verankert, während SNAP-25 über mehrere Cystein-gebundene Palmitoylketten an die Plasmamembran gebunden ist. Der trans- SNARE-Kernkomplex ist ein Vier-Helix-Bündel, wobei eine -Helix von Syntaxin 1, eine -Helix von Synaptobrevin und zwei -Helices von SNAP-25 beigesteuert werden. ${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$

Es wurde gezeigt, dass die Plasmamembran- residenten SNAREs in unterschiedlichen Mikrodomänen oder Clustern vorhanden sind, deren Integrität für die exocytotische Kompetenz der Zelle wesentlich ist.

Membranfusion

Schichtung des Kern-SNARE-Komplexes. In der Mitte befindet sich die null hydrophile Ionenschicht, flankiert von hydrophoben Leucin-Reißverschlussschichten.

Während der Membranfusion verbinden sich v-SNARE- und t-SNARE-Proteine ​​auf separaten Membranen zu einem trans-SNARE-Komplex, auch bekannt als "SNAREpin". Je nach Fusionsstadium der Membranen können diese Komplexe unterschiedlich bezeichnet werden.

Während der Fusion von trans- SNARE-Komplexen verschmelzen die Membranen und SNARE-Proteine, die nach der Fusion an der Komplexbildung beteiligt sind, werden dann als " cis "-SNARE-Komplex bezeichnet, da sie sich nun in einer einzigen (oder cis ) resultierenden Membran befinden. Nach der Fusion wird der cis- SNARE-Komplex durch ein Adapterprotein, alpha-SNAP, gebunden und zerlegt . Dann katalysiert die hexamere ATPase (vom AAA- Typ) namens NSF die ATP -abhängige Entfaltung der SNARE-Proteine ​​und gibt sie zum Recycling ins Zytosol frei.

Es wird angenommen, dass SNAREs die wichtigsten Komponenten der Fusionsmaschinerie sind und unabhängig von zusätzlichen zytosolischen akzessorischen Proteinen funktionieren können. Dies wurde durch die Konstruktion von "umgedrehten" SNAREs demonstriert, bei denen die SNARE-Domänen dem extrazellulären Raum und nicht dem Zytosol zugewandt sind. Wenn Zellen, die v-SNAREs enthalten, Zellen kontaktieren, die t-SNAREs enthalten, bilden sich trans- SNARE-Komplexe und es erfolgt eine Zell-Zell-Fusion.

Komponenten

Der Kern-SNARE-Komplex ist ein 4- Helix-Bündel. Synaptobrevin und Syntaxin tragen jeweils eine -Helix bei, während SNAP-25 mit zwei -Helices (abgekürzt als Sn1 und Sn2) beteiligt ist. Die wechselwirkenden Aminosäurereste, die den SNARE-Komplex zippen, können in Schichten gruppiert werden. Jede Schicht hat 4 Aminosäurereste – einen Rest für jede der 4 -Helices. Im Zentrum des Komplexes befindet sich die Nullionenschicht, die aus einem Arginin (R)- und drei Glutamin (Q) -Resten besteht und von Leucin-Zippern flankiert wird . Die Schichten '-1', '+1' und '+2' im Zentrum des Komplexes folgen am ehesten der idealen Leucin-Reißverschluss-Geometrie und Aminosäurezusammensetzung. ${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$${\displaystyle\alpha}$

Die Null - ionische Schicht besteht aus R56 von VAMP-2, Q226 von Syntaxin-1A, Q53 und Q174 von Sn1 aus Sn2 und ist vollständig innerhalb der Leucin-Reißverschluß - Schichten begraben. Die positiv geladene Guanidinogruppe des Arginin (R)-Restes wechselwirkt mit den Carboxylgruppen von jedem der drei Glutamin (Q)-Reste.

Die flankierenden Leucin-Reißverschlussschichten dienen als wasserdichte Versiegelung, um die ionischen Wechselwirkungen vom umgebenden Lösungsmittel abzuschirmen . Exposition der Null ionischen Schicht mit dem Wasserlösemittel durch die flankierenden Leucinzipper führt zu einer Instabilität des SNARE - Komplexes zu brechen und ist der putative Mechanismus , durch die -Snap und NSF recycle die SNARE - Komplexe nach der Beendigung des synaptischen Vesikels Exozytose . ${\displaystyle\alpha}$

Mechanismus der Membranfusion

Montage

Darstellung der Bildung eines trans- SNARE-Komplexes. Zeigt, wie Munc18 während der Komplexbildung mit den SNARE-Proteinen interagiert.

SNARE-Proteine ​​müssen sich zu trans- SNARE-Komplexen zusammenfügen, um die Kraft bereitzustellen, die für die Vesikelfusion erforderlich ist . Die vier α-Helix- Domänen (jeweils 1 von Synaptobrevin und Syntaxin und 2 von SNAP-25 ) kommen zusammen, um ein Coiled-Coil-Motiv zu bilden . Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Assemblierungsprozess ist die Assoziation der Syntaxin-SNARE-Domäne, da sie sich normalerweise in einem "geschlossenen" Zustand befindet, in dem sie nicht in der Lage ist, mit anderen SNARE-Proteinen zu interagieren. Wenn Syntaxin in einem offenen Zustand ist, beginnt die Bildung des trans- SNARE-Komplexes mit der Assoziation der vier SNARE-Domänen an ihren N-Termini . Die SNARE-Domänen bilden ein Coiled-Coil-Motiv in Richtung der C-Termini ihrer jeweiligen Domänen.

Es wird angenommen, dass das SM-Protein Munc18 eine Rolle beim Aufbau des SNARE-Komplexes spielt, obwohl der genaue Wirkmechanismus noch umstritten ist. Es ist bekannt, dass die Klammer von Munc18 Syntaxin in einer geschlossenen Konformation durch Bindung an seine α-helikalen SNARE-Domänen einschließt , was Syntaxin daran hindert, in SNARE-Komplexe einzutreten (wodurch die Fusion gehemmt wird ). Die Klammer ist jedoch auch in der Lage, das gesamte Vier-Helix-Bündel des trans- SNARE-Komplexes zu binden. Eine Hypothese besagt, dass die Munc18-Schnalle während des Zusammenbaus des SNARE-Komplexes geschlossenes Syntaxin freisetzt, mit dem N-terminalen Peptid von Syntaxin assoziiert bleibt (was die Assoziation der Syntaxin-SNARE-Domäne mit anderen SNARE-Proteinen ermöglicht) und sich dann wieder an die neu gebildeten vier -Helix-SNARE-Komplex. Dieser mögliche Mechanismus der Dissoziation und anschließenden Reassoziation mit den SNARE-Domänen könnte kalziumabhängig sein. Dies unterstützt die Idee, dass Munc18 eine wichtige regulatorische Rolle bei der Vesikelfusion spielt ; Unter normalen Bedingungen wird der SNARE - Komplex Bildung durch Munc18 verhindert werden, aber wenn die Munc18 ausgelöst wird helfen tatsächlich in SNARE-komplexen Montag und dadurch als ein Fusions wirkt Katalysator .

Reißverschluss und Fusion Porenöffnung

Diese Abbildung gibt einen einfachen Überblick über die Interaktion von SNARE-Proteinen mit Vesikeln während der Exozytose. Zeigt die komplexe Montage, Reißverschlüsse und Demontage von SNARE.

Die Membranfusion ist eine energetisch anspruchsvolle Reihe von Ereignissen, die die Translokation von Proteinen in der Membran und die Zerstörung der Lipiddoppelschicht erfordert, gefolgt von der Neubildung einer stark gekrümmten Membranstruktur. Der Vorgang des Zusammenbringens zweier Membranen erfordert eine Eingangsenergie, um die abstoßenden elektrostatischen Kräfte zwischen den Membranen zu überwinden. Der Mechanismus, der die Bewegung von membranassoziierten Proteinen weg von der Membrankontaktzone vor der Fusion reguliert, ist unbekannt, aber es wird angenommen, dass die lokale Zunahme der Membrankrümmung zu diesem Prozess beiträgt. SNAREs erzeugen Energie durch Protein-Lipid- und Protein-Protein-Wechselwirkungen, die als treibende Kraft für die Membranfusion wirken.

Ein Modell stellt die Hypothese auf, dass die Kraft, die erforderlich ist, um zwei Membranen während der Fusion zusammenzubringen, von der Konformationsänderung in trans- SNARE-Komplexen zur Bildung von cis- SNARE-Komplexen herrührt. Die aktuelle Hypothese, die diesen Prozess beschreibt, wird als SNARE-"Zippering" bezeichnet.

Wenn der trans- SNARE-Komplex gebildet wird, befinden sich die SNARE-Proteine ​​immer noch auf gegenüberliegenden Membranen. Während sich die SNARE-Domänen in einem spontanen Prozess weiter winden , bilden sie ein viel engeres, stabileres Vier-Helix-Bündel. Während dieses "Zipperns" des SNARE-Komplexes wird ein Bruchteil der durch die Bindung freigesetzten Energie als molekularer Biegestress in den einzelnen SNARE-Motiven gespeichert. Es wird postuliert, dass dieser mechanische Stress in den halbstarren Linkerregionen zwischen den Transmembrandomänen und dem SNARE-Helixbündel gespeichert wird. Die energetisch ungünstige Biegung wird minimiert, wenn sich der Komplex peripher zum Ort der Membranfusion bewegt. Dadurch überwindet die Entspannung die abstoßenden Kräfte zwischen Vesikel und Zellmembran und drückt die beiden Membranen zusammen.

Es wurden mehrere Modelle vorgeschlagen, um den nachfolgenden Schritt – die Bildung von Stiel und Fusionsporen – zu erklären. Die genaue Natur dieser Prozesse bleibt jedoch umstritten. Gemäß der „Reißverschluss“-Hypothese übt das sich zusammenziehende Helixbündel bei der Bildung des SNARE-Komplexes eine Torsionskraft auf die Transmembran(TM)-Domänen von Synaptobrevin und Syntaxin aus . Dies führt dazu, dass sich die TM-Domänen innerhalb der separaten Membranen neigen, wenn sich die Proteine ​​enger zusammenrollen. Die instabile Konfiguration der TM-Domänen führt schließlich dazu, dass die beiden Membranen fusionieren und die SNARE-Proteine ​​innerhalb derselben Membran zusammenkommen, was als " cis "-SNARE-Komplex bezeichnet wird. Als Ergebnis der Lipidumlagerung öffnet sich eine Fusionspore und lässt den chemischen Inhalt des Vesikels in die äußere Umgebung entweichen.

Die Kontinuumserklärung der Stielbildung legt nahe, dass die Membranfusion mit einem infinitesimalen Radius beginnt, bis sie sich radial zu einer stielartigen Struktur ausdehnt. Eine solche Beschreibung berücksichtigt jedoch nicht die molekulare Dynamik von Membranlipiden. Neuere molekulare Simulationen zeigen, dass die unmittelbare Nähe der Membranen eine Spreizung der Lipide ermöglicht, wobei eine Population von Lipiden ihre hydrophoben Schwänze in die benachbarte Membran einfügt – effektiv einen "Fuß" in jeder Membran halten. Die Auflösung des gespreizten Lipidzustandes erfolgt spontan, um die Stielstruktur zu bilden. Aus dieser molekularen Sicht ist der gespreizte Lipid-Zwischenzustand die geschwindigkeitsbestimmende Barriere und nicht die Bildung des Stiels, der nun zum Minimum der freien Energie wird. Die energetische Barriere für die Bildung der Spreiz-Lipid-Konformation ist direkt proportional zum Abstand zwischen den Membranen. Die SNARE-Komplexe und ihr Zusammenpressen der beiden Membranen könnten daher die zur Überwindung der Barriere erforderliche freie Energie bereitstellen.

Demontage

Der Energieeintrag, der für die SNARE-vermittelte Fusion erforderlich ist, stammt aus der Zerlegung des SNARE-Komplexes. Die vermutete Energiequelle ist N-Ethylmaleinimid-sensitiver Faktor (NSF) , eine ATPase , die an der Membranfusion beteiligt ist . NSF-Homohexamere binden und dissoziieren zusammen mit dem NSF- Cofaktor α-SNAP den SNARE-Komplex durch Kopplung des Prozesses mit ATP-Hydrolyse . Dieser Prozess ermöglicht die Wiederaufnahme von Synaptobrevin zur weiteren Verwendung in Vesikeln , während die anderen SNARE-Proteine ​​mit der Zellmembran assoziiert bleiben .

Die dissoziierten SNARE-Proteine ​​haben einen höheren Energiezustand als der stabilere cis- SNARE-Komplex. Es wird angenommen, dass die Energie, die die Fusion antreibt , aus dem Übergang zu einem cis- SNARE-Komplex mit niedrigerer Energie stammt. Die ATP-Hydrolyse-gekoppelte Dissoziation von SNARE-Komplexen ist eine Energieinvestition, die mit dem „Cocking the Gun“ vergleichbar ist, sodass der Prozess nach dem Auslösen der Vesikelfusion spontan und mit optimaler Geschwindigkeit abläuft . Ein vergleichbarer Vorgang findet in Muskeln statt, bei denen die Myosinköpfe zunächst ATP hydrolysieren müssen, um die notwendige Konformation für die Interaktion mit Aktin und den anschließenden Kraftstoß anzupassen.

Regulatorische Auswirkungen auf die Exozytose

Regulierung über SNAP-25 Palmitoylierung

Das Q-SNARE-Protein Synaptosomal-assoziiertes Protein 25 ( SNAP-25 ) besteht aus zwei α-helikalen Domänen, die durch einen Random-Coil- Linker verbunden sind. Die Random-Coil-Linker-Region ist am bemerkenswertesten für ihre vier Cysteinreste . Die α-helikalen Domänen verbinden sich mit denen von Syntaxin und Synaptobrevin (auch als Vesikel- assoziiertes Membranprotein oder VAMP bekannt), um den 4-α-Helix-Coiled-Coil-SNARE-Komplex zu bilden, der für eine effiziente Exozytose entscheidend ist .

Während Syntaxin und Synaptobrevin enthält beide Transmembrandomänen , die für das Andocken mit Ziel- und Vesikels erlauben Membranen bzw. SNAP-25 beruht auf der Palmitoylierung von Cystein - Resten in seiner Zufallsknäuel Region zu dem Zielmembran Andocken. Einige Studien haben vorgeschlagen, dass die Assoziation mit Syntaxin über SNARE-Wechselwirkungen die Notwendigkeit solcher Andockmechanismen ausschließt. Syntaxin- Knockdown- Studien zeigten jedoch keine Abnahme von membrangebundenem SNAP-25, was darauf hindeutet, dass alternative Andockmöglichkeiten existieren. Die kovalente Bindung von Fettsäureketten an SNAP-25 über Thioesterbindungen mit einem oder mehreren Cysteinresten sorgt daher für die Regulierung des Andockens und letztendlich der SNARE-vermittelten Exocytose . Dieser Prozess wird durch ein spezialisiertes Enzym namens DHHC- Palmitoyltransferase vermittelt. Es wurde auch gezeigt , dass die Cystein - reiche Domäne von SNAP-25 schwach mit der Plasmamembran assoziiert , was es möglicherweise ermöglicht , dass sie für die nachfolgende Palmitoylierung in der Nähe des Enzyms lokalisiert wird . Die Umkehrung dieses Prozesses wird von einem anderen Enzym namens Palmitoyl-Protein-Thioesterase durchgeführt (siehe Abbildung).

Eine vereinfachte Darstellung der Palmitoylierung eines Cysteinrestes in einem Protein

Es wird auch angenommen, dass die Verfügbarkeit von SNAP-25 im SNARE-Komplex möglicherweise über die Lokalisierung von Lipid-Mikrodomänen in der Zielmembran räumlich reguliert wird. Palmitoylierte Cysteinreste konnten über eine günstige Lipidumgebung (möglicherweise cholesterinreich ) komplementär zu den an die Cysteinreste von SNAP-25 gebundenen Fettsäureketten an der gewünschten Zielmembranregion lokalisiert werden .

SNAP-25-Regulierung von spannungsgesteuerten Ca2+-Kanälen in neuronalen Axonterminals

Wenn ein Aktionspotential das Axonterminal erreicht , stimulieren Depolarisationsereignisse die Öffnung von spannungsgesteuerten Calciumkanälen (VGCCs), was den schnellen Einstrom von Calcium entlang seines elektrochemischen Gradienten ermöglicht . Calcium stimuliert über die Bindung mit Synaptotagmin 1 die Exozytose . Es wurde jedoch gezeigt, dass SNAP-25 die VGCC- Funktion in glutamatergen neuronalen Zellen negativ reguliert . SNAP-25 führt zu einer Verringerung der Stromdichte durch VGCCs und daher zu einer Verringerung der Calciummenge , die das Synaptotagmin bindet , was zu einer Verringerung der neuronalen glutamatergen Exozytose führt . Umgekehrt Unterexpression von SNAP-25 ermöglicht eine Erhöhung in VGCC Stromdichte und Erhöhung der Exozytose.

Weitere Untersuchungen haben mögliche Zusammenhänge zwischen der Über-/Unterexpression von SNAP-25 und einer Vielzahl von Hirnerkrankungen vorgeschlagen . Bei der Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung oder ADHS wurden Polymorphismen am SNAP-25 -Genlocus beim Menschen mit der Krankheit in Verbindung gebracht, was auf eine mögliche Rolle bei ihrer Manifestation hindeutet. Dies wird auch durch heterogene SNAP-25- Knockout-Studien nahegelegt , die an Mäusen mit Coloboma- Mutanten durchgeführt wurden und zu phänotypischen Eigenschaften von ADHS führten. Studien haben auch eine Korrelation zwischen der Über-/Unterexpression von SNAP-25 und dem Auftreten von Schizophrenie gezeigt .

Syntaxin und die Habc-Domäne

Syntaxin besteht aus einer Transmembrandomäne (TMD), einer alpha-helikalen SNARE-Domäne, einer kurzen Linker-Region und der Habc-Domäne, die aus drei alpha-helikalen Regionen besteht. Die SNARE-Domäne in Syntaxin dient als Zielstelle für das Andocken von SNAP-25 und Synaptobrevin , um das Vier-Helix-Bündel zu bilden, das für den SNARE-Komplex und die anschließende Fusion erforderlich ist . Die Habc-Domäne dient jedoch als autoinhibitorische Domäne in Syntaxin. Es wurde gezeigt, dass es sich umfaltet und mit der SNARE-Domäne von Syntaxin assoziiert, was einen "geschlossenen" Zustand hervorruft, wodurch eine physikalische Barriere für die Bildung des SNARE- Motivs entsteht . Umgekehrt kann die Habc-Domäne wieder von der SNARE-Domäne dissoziieren, wobei Syntaxin frei bleibt, um sich sowohl mit SNAP-25 als auch mit Synaptobrevin zu assoziieren .

Syntaxin 1B und leicht freisetzbarer Vesikelpool

Es gibt eine immense Vielfalt an Syntaxin- Subtypen mit 15 Varianten im menschlichen Genom. Es wurde vorgeschlagen, dass Syntaxin1B eine Rolle bei der Regulierung der Anzahl synaptischer Vesikel spielt, die für die Exozytose im Axonterminal bereit sind. Dies wird auch als leicht freisetzbarer Pool (RRP) von Vesikeln bezeichnet . Eine Knock-out-Studie aus dem Jahr 2014 zeigte, dass das Fehlen von Syntaxin1B zu einem signifikanten Rückgang der UVP-Größe führte.

Giftstoffe

Viele Neurotoxine wirken sich direkt auf SNARE-Komplexe aus. Toxine wie Botulinum- und Tetanus- Toxine wirken, indem sie auf die SNARE-Komponenten abzielen. Diese Toxine verhindern ein ordnungsgemäßes Vesikel-Recycling und führen zu schlechter Muskelkontrolle, Krämpfen, Lähmungen und sogar zum Tod.

Botulinum-Neurotoxin

Botulinumtoxin (BoNT) ist eines der stärksten Giftstoffe, die jemals entdeckt wurden. Es ist ein proteolytisches Enzym, das SNARE-Proteine in Neuronen spaltet . Seine Proteinstruktur besteht aus zwei Peptiduntereinheiten, einer schweren Kette (100 kDas) und einer leichten Kette (50 kDas), die durch eine Disulfidbindung zusammengehalten werden . Die Wirkung von BoNT folgt einem 4-Stufen-Mechanismus, der die Bindung an die neuronale Membran, Endozytose , Membrantranslokation und Proteolyse von SNARE-Proteinen umfasst.

Zielen Sie auf die SNARE-Proteine ​​von Botulinum Neurotoxin (BoNT) und Tetanus Neurotoxin (TeNT) im Axonterminal .

In ihrem Wirkmechanismus wird die schwere Kette von BoNT zuerst verwendet, um ihre neuronalen Ziele zu finden und an die Ganglioside und Membranproteine ​​präsynaptischer Neuronen zu binden. Als nächstes wird das Toxin dann in die Zellmembran endozytiert. Die schwere Kette erfährt eine Konformationsänderung, die für die Translokation der leichten Kette in das Cytosol des Neurons wichtig ist . Nachdem die leichte Kette von BoNT schließlich in das Zytosol des anvisierten Neurons gebracht wurde, wird sie von der schweren Kette freigesetzt, so dass sie ihre aktiven Schnittstellen an den SNARE-Proteinen erreichen kann. Die leichte Kette wird durch die Reduktion der Disulfidbindung, die die beiden zusammenhält, von der schweren Kette freigesetzt. Die Reduktion dieser Disulfidbindung durch das NADPH - vermittelt Thioredoxinreduktase - Thioredoxin - System. Die leichte Kette von BoNT wirkt als Metalloprotease auf SNARE-Proteinen, die von Zn(II)-Ionen abhängig ist, diese spaltet und eliminiert ihre Funktion bei der Exozytose .

Es gibt 8 bekannte Isotypen von BoNT, BoNT/A – BoNT/H, jeder mit unterschiedlichen spezifischen Schnittstellen auf SNARE-Proteinen. SNAP25 , ein Mitglied der SNARE-Proteinfamilie, das sich in der Zellmembran befindet, wird von den BoNT-Isotypen A, C und E gespalten. Die Spaltung von SNAP-25 durch diese Isotypen von BoNT hemmt ihre Funktion bei der Bildung des SNARE-Komplexes für die Fusion stark von Bläschen zur synaptischen Membran. BoNT/C zielt auch auf Syntaxin -1 ab, ein weiteres SNARE-Protein, das sich in der synaptischen Membran befindet. Es degeneriert diese Syntaxin-Proteine ​​mit einem ähnlichen Ergebnis wie bei SNAP-25. Ein drittes SNARE-Protein, Synaptobrevin (VAMP), befindet sich auf Zellvesikeln . VAMP2 wird von den BoNT-Isotypen B, D und F in synaptischen Neuronen gezielt und gespalten. Die Ziele dieser verschiedenen Isotypen von BoNT sowie Tetanus Neurotoxin (TeNT) sind in der Abbildung rechts dargestellt.

In jedem dieser Fälle verursacht Botulinum Neurotoxin funktionelle Schäden an SNARE-Proteinen, die erhebliche physiologische und medizinische Auswirkungen haben. Durch die Schädigung der SNARE-Proteine ​​verhindert das Toxin, dass synaptische Vesikel mit der synaptischen Membran verschmelzen und ihre Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freisetzen . Durch die Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung in den synaptischen Spalt können Aktionspotentiale nicht zur Stimulierung von Muskelzellen propagiert werden. Dies führt zu Lähmungen der Infizierten und kann in schweren Fällen zum Tod führen. Obwohl die Wirkung von Botulinum Neurotoxin tödlich sein kann, wurde es auch als Therapeutikum in medizinischen und kosmetischen Behandlungen verwendet.

Tetanus-Neurotoxin

Die Aufschlüsselung der Verantwortlichkeiten und Mechanismen der schweren (HC) und leichten Kette (LC) des Tetanus-Neurotoxins: Das HC unterstützt die Bindung von TeNT sowohl an den Gangliosidrezeptor als auch an den endgültigen Rezeptor. Sobald sich TeNT im Vesikel im inhibitorischen Interneuronraum befindet, unterstützt das HC die Translokation des LC in das Zytoplasma. Dann hemmt das LC, gekennzeichnet durch Zink-Endopeptidase-Aktivität, die Neurotransmission durch Spaltung von Synaptobrevin 1.

Tetanus - Toxin oder TeNT, besteht aus einer schweren Kette (100 kDa) und eine leichten Kette (50 kDa) durch eine verbundene Disulfid - Bindung. Die schwere Kette ist für die neurospezifische Bindung von TeNT an die Nervenendigungsmembran, die Endozytose des Toxins und die Translokation der leichten Kette in das Zytosol verantwortlich. Die leichte Kette weist eine zinkabhängige Endopeptidase- oder insbesondere Matrixmetalloproteinase (MMP)-Aktivität auf, durch die eine Spaltung von Synaptobrevin oder VAMP durchgeführt wird.

Damit die leichte Kette von TeNT aktiviert werden kann, muss an jedes Toxinmolekül ein Zinkatom gebunden sein. Wenn Zink gebunden ist, wird die Reduktion der Disulfidbindung hauptsächlich über das NADPH-Thioredoxin-Reduktase-Thioredoxin- Redox-System durchgeführt. Dann ist die leichte Kette frei, um die Gln76-Phe77-Bindung von Synaptobrevin zu spalten. Die Spaltung von Synaptobrevin beeinflusst die Stabilität des SNARE-Kerns, indem sie ihn daran hindert, in die niederenergetische Konformation einzutreten, die das Ziel der NSF- Bindung ist. Diese Spaltung von Synaptobrevin ist das letzte Ziel von TeNT, und selbst in niedrigen Dosen hemmt das Neurotoxin die Neurotransmitter- Exozytose .

Rolle bei der Freisetzung von Neurotransmittern

Neurotransmitter sind in gespeicherten leicht deaktivierbare Pools von Vesikeln innerhalb des begrenzten präsynaptischen Terminal . Während der Neurosekretion / Exozytose spielen SNAREs eine entscheidende Rolle beim Andocken, Priming, Fusion und Synchronisation der Neurotransmitterfreisetzung in den synaptischen Spalt .

Der erste Schritt bei der synaptischen Vesikelfusion ist das Tethering, bei dem die Vesikel aus dem Reservepool in physischen Kontakt mit der Membran gebracht werden. An der Membran wird Munc-18 zunächst in einer geschlossenen Struktur an Syntaxin 1A gebunden . Es wird postuliert, dass die Dissoziation von Munc-18 vom Komplex Syntaxin 1A freisetzt, um an die v-SNARE-Proteine ​​zu binden. Der nächste Schritt der Freisetzung ist das Andocken von Vesikeln, wobei die v- und t-SNARE-Proteine ​​vorübergehend Calcium-unabhängig assoziieren. Die Vesikel werden dann geprimt, wobei die SNARE- Motive eine stabile Wechselwirkung zwischen Vesikel und Membran bilden. Complexine stabilisieren den geprimten SNARE-Komplex und machen die Vesikel bereit für eine schnelle Exozytose.

Die Spanne der präsynaptischen Membran, die die präsynaptischen Vesikel und die dichte Ansammlung von SNARE-Proteinen enthält, wird als aktive Zone bezeichnet . Spannungsgesteuerte Calciumkanäle sind um aktive Zonen und öffnen in Reaktion auf Membran hochkonzentriertes Depolarisation an der Synapse. Der Calciumeinstrom wird durch Synaptotagmin 1 wahrgenommen , das wiederum Komplexinprotein verdrängt und es dem Vesikel ermöglicht, mit der präsynaptischen Membran zu verschmelzen, um Neurotransmitter freizusetzen. Es wurde auch gezeigt, dass die spannungsgesteuerten Calciumkanäle direkt mit den t-SNAREs Syntaxin 1A und SNAP-25 sowie mit Synaptotagmin 1 interagieren die Release-Site.

Es gab viele klinische Fälle, die SNARE-Gene mit neuralen Störungen in Verbindung bringen. Ein Mangel an SNAP-25- mRNA wurde im Hippocampus- Gewebe einiger schizophrener Patienten beobachtet, ein SNAP-25-Einzelnukleotid-Polymorphismus ist mit Hyperaktivität bei Autismus-Spektrum-Störungen verbunden und eine Überexpression von SNAP-25B führt zum frühen Auftreten einer bipolaren Störung .

Rolle in der Autophagie

Makroautophagie ist ein kataboler Prozess , der die Bildung von Doppelmembran-gebundenen Organellen, sogenannten Autophagosomen , beinhaltet, die den Abbau zellulärer Komponenten durch Fusion mit Lysosomen unterstützen . Während der Autophagie werden Teile des Zytoplasmas von einer becherförmigen Doppelmembranstruktur namens Phagophor umhüllt und werden schließlich zum Inhalt des vollständig zusammengesetzten Autophagosoms. Die Autophagosom-Biogenese erfordert die Initiierung und das Wachstum von Phagophoren, ein Prozess, von dem einst angenommen wurde, dass er durch die De-novo-Zugabe von Lipiden abläuft. Jüngste Hinweise deuten jedoch darauf hin, dass die Lipide, die zu den wachsenden Phagophoren beitragen, aus zahlreichen Membranquellen stammen, darunter endoplasmatisches Retikulum , Golgi , Plasmamembran und Mitochondrien . SNAREs spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Vesikelfusion während der Phagophorinitiation und -expansion sowie der Autophagosom-Lysosom-Fusion in den späteren Stadien der Autophagie.

Obwohl der Mechanismus der Phagophor-Initiation bei Säugetieren unbekannt ist, wurden SNAREs an der Phagophor-Bildung durch homotypische Fusion von kleinen, Clathrin- beschichteten Einzelmembran-Vesikeln mit Atg16L, dem v-SNARE VAMP7 und seinen Partner-t-SNAREs beteiligt: Syntaxin- 7 , Syntaxin-8 und VTI1B . In Hefe werden die t-SNAREs Sec9p und Sso2p für die Exozytose benötigt und fördern die tubulovesikuläre Knospung von Atg9-positiven Vesikeln, die auch für die Autophagosomen-Biogenese benötigt werden. Das Ausschalten eines dieser SNAREs führt zur Ansammlung kleiner Atg9-haltiger Vesikel, die nicht fusionieren, wodurch die Bildung der präautophagosomalen Struktur verhindert wird.

Neben der Phagophor-Assemblierung sind SNAREs auch bei der Vermittlung der Autophagosom-Lysosom-Fusion wichtig. Bei Säugetieren werden die SNAREs VAMP7 , VAMP8 und VTI1B für die Autophagosom-Lysosom-Fusion benötigt und dieser Prozess wird bei lysosomalen Speicherkrankheiten beeinträchtigt, bei denen sich Cholesterin im Lysosom ansammelt und SNAREs in cholesterinreichen Regionen der Membran sequestriert, wodurch ihr Recycling verhindert wird. Kürzlich wurde Syntaxin 17 ( STX17 ) als Autophagosom-assoziiertes SNARE identifiziert, das mit VAMP8 und SNAP29 interagiert und für die Fusion mit dem Lysosom benötigt wird. STX17 ist auf der äußeren Membran von Autophagosomen lokalisiert, jedoch nicht auf Phagophoren oder anderen Autophagosomen-Vorläufern, was eine vorzeitige Verschmelzung mit dem Lysosom verhindert. In Hefe erfordert die Fusion von Autophagosomen mit Vakuolen (das Hefeäquivalent von Lysosomen) SNAREs und verwandte Proteine ​​wie das Syntaxin-Homolog Vam3, SNAP-25-Homolog Vam7, Ras-like GTPase Ypt7 und das NSF-Orthologe Sec18.

Flexibler Austausch von Komponenten

Es ist bekannt, dass mehrere Komplexe flexibel ein Protein durch ein anderes ersetzen: Zwei Qa-SNAREs in Hefen können sich bis zu einem gewissen Grad gegenseitig ersetzen. Hefen , die den R-SNARE verlieren - Sec22p - automatisch Ebene einer Erhöhung Homolog - Ykt6p - und es ist die gleiche Art und Weise nutzen. Obwohl Drosophilae den Verlust der SNAP-25- Komponente nicht überleben können , kann SNAP-24 sie vollständig ersetzen. Und auch bei Drosophila kann ein R-SNARE, das normalerweise nicht in Synapsen gefunden wird, Synaptobrevin ersetzen .

In Pflanzen

SNAREs kommen auch in Pflanzen vor, und ihr Vorkommen und ihre Rolle sind einigermaßen bekannt. Diese haben oft gefunden worden wesentlich sein Vesikeltransport , einschließlich Zheng et al 1999er findet in Bezug auf Golgi - Vakuolen Handel. Ein Großteil dieser Studie wurde in Arabidopsis durchgeführt .

Verweise

Externe Links

• SNARE+Proteins in der US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• SNARE+Complex in der US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)