Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop - Total internal reflection fluorescence microscope
Ein Total Internal Reflection Fluoreszenzmikroskop ( TIRFM ) ist ein Mikroskoptyp, mit dem ein dünner Bereich einer Probe, üblicherweise weniger als 200 Nanometer, beobachtet werden kann .
Hintergrund
In der Zell- und Molekularbiologie wurde eine große Anzahl molekularer Ereignisse auf Zelloberflächen wie Zelladhäsion , Bindung von Zellen durch Hormone , Sekretion von Neurotransmittern und Membrandynamik mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen untersucht . Jedoch Fluorophore , die an die Probe gebunden sind , die Oberfläche und die in dem umgebenden Medium existiert in einem Gleichgewichtszustand. Wenn diese Moleküle mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop angeregt und nachgewiesen werden, wird die resultierende Fluoreszenz dieser an die Oberfläche gebundenen Fluorophore aufgrund der viel größeren Population nicht gebundener Moleküle häufig von der Hintergrundfluoreszenz überwältigt. TIRFM ermöglicht die selektive Anregung der oberflächengebundenen Fluorophore, während nicht gebundene Moleküle nicht angeregt werden und nicht fluoreszieren. Aufgrund der Oberflächenselektivität im Submikronbereich ist TIRFM zu einer Methode der Wahl für die Detektion einzelner Moleküle geworden.
Überblick
Die Idee, Totalreflexion zur Beleuchtung von Zellen zu verwenden, die mit der Glasoberfläche in Kontakt stehen, wurde erstmals 1956 von EJ Ambrose beschrieben. Diese Idee wurde dann Anfang der 1980er Jahre von Daniel Axelrod an der Universität von Michigan, Ann Arbor, als TIRFM erweitert. Ein TIRFM verwendet eine abklingende Welle , um Fluorophore in einem begrenzten Bereich der Probe unmittelbar neben der Glas-Wasser-Grenzfläche selektiv zu beleuchten und anzuregen. Das abklingende elektromagnetische Feld fällt exponentiell von der Grenzfläche ab und dringt somit bis zu einer Tiefe von nur etwa 100 nm in das Probenmedium ein. Somit ermöglicht das TIRFM eine selektive Visualisierung von Oberflächenbereichen wie der basalen Plasmamembran (die etwa 7,5 nm dick sind) von Zellen, wie in der obigen Abbildung gezeigt. Es ist jedoch zu beachten, dass der sichtbare Bereich mindestens einige hundert Nanometer breit ist, so dass die zytoplasmatische Zone unmittelbar unter der Plasmamembran während der TIRF-Mikroskopie notwendigerweise zusätzlich zur Plasmamembran sichtbar gemacht wird. Die selektive Visualisierung der Plasmamembran macht die Merkmale und Ereignisse auf der Plasmamembran in lebenden Zellen mit hoher axialer Auflösung wieder .
TIRF kann auch verwendet werden, um die Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls zu beobachten , was es zu einem wichtigen Werkzeug der Biophysik und der quantitativen Biologie macht. TIRF-Mikroskopie wurde auch beim Einzelmoleküldetektion von DNA-Biomarkern und bei der SNP-Diskriminierung angewendet.
Es wurde gezeigt, dass Cis-Geometrie (TIRFM durch Objektiv) und Transgeometrie (TIRFM auf Prismen- und Lichtleiterbasis) eine unterschiedliche Qualität des Effekts der Totalreflexion liefern. Bei der Transgeometrie sind der Anregungslichtweg und der Emissionskanal getrennt, während sie bei TIRFM vom Objektivtyp das Objektiv und andere optische Elemente des Mikroskops gemeinsam nutzen. Es wurde gezeigt, dass prismenbasierte Geometrie eine saubere evaneszente Welle erzeugt, deren exponentieller Zerfall nahe an der theoretisch vorhergesagten Funktion liegt. Bei objektivbasiertem TIRFM ist die abklingende Welle jedoch mit intensivem Streulicht verunreinigt . Es wurde gezeigt, dass die Intensität des Streulichts 10 bis 15% der abklingenden Welle beträgt, was es schwierig macht, Daten zu interpretieren, die durch objektives TIRFM erhalten wurden
Verweise
- Axelrod, Daniel (1. November 2001). "Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology" (PDF) . Verkehr . 2 (11): 764–774. doi : 10.1034 / j.1600-0854.2001.21104.x . hdl : 2027,42 / 72779 . PMID 11733042 . S2CID 15202097 .
Externe Links
- Interaktive Fluoreszenzfarbstoff- und Filterdatenbank Carl Zeiss Interaktive Fluoreszenzfarbstoff- und Filterdatenbank.
- TIRF-Mikroskopie: Einführung und Anwendungen TIRF-Tutorial von Microscopy U.
- TIRF-Mikroskopie: Übersicht TIRF-Tutorial vom Olympus Microscopy Resource Center
- Olympus TIRFM-Mikroskope Kommerzielle TIRF-Mikroskopsysteme
- Carl Zeiss Laser TIRF 3 kommerzielle TIRF-Mikroskopsysteme
- Lichtleiter- und Prismenbasierte TIRF-Mikroskopie TIRF-Labs.com: Kommerzielle TIRF-Mikroskopie und -Spektroskopie. Auswahl der TIRFM-Geometrie für Ihre Anwendung
- TIRF-FLIM-Mikroskopie Lambert Instruments TIRF-FLIM-Mikroskopie
- Schwartz-Forschungsgruppe, CU-Boulder- Forschungsgruppe für Einzelmolekül-Bildgebung