Genwaffe - Gene gun
In der Gentechnik ist eine Genkanone oder ein biolistisches Partikelabgabesystem ein Gerät, das verwendet wird, um exogene DNA ( Transgene ), RNA oder Proteine an Zellen zu liefern. Durch Beschichten von Schwermetallpartikeln mit einem interessierenden Gen und Abfeuern dieser Mikroprojektile in Zellen unter Verwendung mechanischer Kraft kann eine Integration gewünschter genetischer Information in gewünschte Zellen eingeführt werden. Die Technik, die mit einer solchen Mikroprojektil-Zufuhr von DNA verbunden ist, wird oft als Biolistik bezeichnet .
Dieses Gerät ist in der Lage, fast jeden Zelltyp zu transformieren und ist nicht auf die Transformation des Zellkerns beschränkt; es kann auch Organellen, einschließlich Plastiden und Mitochondrien, transformieren .
Gen-Waffen-Design
Die Gen-Pistole war ursprünglich eine Crosman -Luftpistole, die so modifiziert wurde, dass sie dichte Wolframpartikel abfeuert. Es wurde zwischen 1983 und 1986 von John C Sanford , Ed Wolf und Nelson Allen an der Cornell University zusammen mit Ted Klein von DuPont erfunden . Das ursprüngliche Ziel waren Zwiebeln (ausgewählt wegen ihrer großen Zellgröße) und das Gerät wurde verwendet, um Partikel zu transportieren mit einem Markergen beschichtet, das ein Signal weiterleitet, wenn die richtige Insertion des DNA-Transkripts stattfindet. Die genetische Transformation wurde bei beobachteter Expression des Markergens in Zwiebelzellen gezeigt.
Die frühesten maßgefertigten Genwaffen (hergestellt von Nelson Allen) verwendeten eine 22-Kaliber- Nagelpistolenpatrone , um einen Polyethylenzylinder (Kugel) in einen 22-Kaliber-Douglas-Lauf zu treiben . Ein Tröpfchen des Wolframpulvers mit genetischem Material beschichtet ist, wurde auf die Kugel gelegt und in eine abgeschossen Petrischale unten. Die Kugel schweißte an die Scheibe unter der Petriplatte, und das genetische Material wurde mit einem Donut-Effekt in die Probe gesprengt, der Verwüstung in der Mitte der Probe mit einem Ring guter Transformation um den Umfang verursachte. Die Pistole war mit einer Vakuumpumpe verbunden und wurde während des Schießens unter Vakuum gesetzt. Das frühe Design wurde von einer Rumsey-Loomis (einer lokalen Maschinenwerkstatt in der Mecklenburg Road in Ithaca, NY, USA) in limitierter Auflage hergestellt.
Biolistics, Inc. verkaufte Dupont die Rechte zur Herstellung und zum Vertrieb eines aktualisierten Geräts mit Verbesserungen, einschließlich der Verwendung von Helium als nicht-explosivem Treibmittel und einem Mechanismus zur Kollisionsabgabe mit mehreren Scheiben, um die Beschädigung von Gewebeproben zu minimieren. Andere Schwermetalle wie Gold und Silber werden auch verwendet, um genetisches Material zu liefern, wobei Gold aufgrund der geringeren Zytotoxizität im Vergleich zu Wolfram-Projektilträgern bevorzugt wird.
Biolistisches Konstruktdesign
Die biolistische Transformation beinhaltet die Integration eines funktionellen DNA-Fragments – bekannt als DNA-Konstrukt – in Zielzellen. Ein Genkonstrukt ist eine DNA-Kassette, die alle erforderlichen regulatorischen Elemente für die richtige Expression im Zielorganismus enthält. Während Genkonstrukte in ihrem Design in Abhängigkeit vom gewünschten Ergebnis des Transformationsverfahrens variieren können, enthalten alle Konstrukte typischerweise eine Kombination aus einer Promotorsequenz , einer Terminatorsequenz , dem interessierenden Gen und einem Reportergen .
Promoter:
Promotoren kontrollieren den Ort und das Ausmaß der Genexpression und fungieren als „Lenkrad und Gaspedal“ eines Gens. Promotoren gehen dem interessierenden Gen im DNA-Konstrukt voraus und können durch Labordesign verändert werden, um die Transgenexpression fein abzustimmen. Der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus ist ein Beispiel für einen häufig verwendeten Promotor, der zu einer robusten konstitutiven Genexpression in Pflanzen führt.
Terminator:
Terminatorsequenzen sind für die richtige Genexpression erforderlich und werden nach der kodierenden Region des interessierenden Gens innerhalb des DNA-Konstrukts platziert. Ein üblicher Terminator für die biolistische Transformation ist der NOS-Terminator, der von Agrobacterium tumefaciens stammt . Aufgrund der hohen Häufigkeit der Verwendung dieses Terminators in gentechnisch veränderten Pflanzen wurden Strategien entwickelt, um sein Vorhandensein in der Nahrungsversorgung zu erkennen und auf nicht autorisierte gentechnisch veränderte Pflanzen zu überwachen.
Reportergen:
Ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert, ist ein übliches Element innerhalb von DNA-Konstrukten und wird verwendet, um nach richtig transformierten Zellen zu selektieren. Der gewählte selektierbare Marker hängt von der zu transformierenden Spezies ab, ist jedoch typischerweise ein Gen, das Zellen eine Entgiftungskapazität für bestimmte Herbizide oder Antibiotika wie Kanamycin , Hygromycin B oder Glyphosat verleiht .
Zusätzliche Elemente:
Optionale Komponenten eines DNA-Konstrukts umfassen Elemente wie Cre-lox- Sequenzen, die eine kontrollierte Entfernung des Konstrukts aus dem Zielgenom ermöglichen. Solche Elemente werden vom Konstruktentwickler ausgewählt, um neben dem interessierenden Hauptgen spezielle Funktionen auszuführen.
Anwendung
Genkanonen werden meistens mit Pflanzenzellen verwendet. Aber auch bei Menschen und anderen Tieren gibt es viele potenzielle Verwendungsmöglichkeiten.
Pflanzen
Das Ziel einer Genkanone ist oft ein Kallus undifferenzierter Pflanzenzellen oder eine Gruppe unreifer Embryonen, die auf Gelmedium in einer Petrischale wachsen. Nachdem die DNA-beschichteten Goldpartikel wurden an die Zellen abgegeben wurde, wird die DNA als Matrize für die Transkription (transiente Expression) verwendet , und manchmal integriert sie in ein Pflanzenchromosom ( ‚stabil‘ Transformation)
Wenn das gelieferte DNA-Konstrukt einen selektierbaren Marker enthält, können stabil transformierte Zellen selektiert und unter Verwendung von Gewebekulturverfahren kultiviert werden. Wenn zum Beispiel das zugeführte DNA-Konstrukt ein Gen enthält, das Resistenz gegen ein Antibiotikum oder Herbizid verleiht, dann können stabil transformierte Zellen durch Einschließen dieses Antibiotikums oder Herbizids in das Gewebekulturmedium selektiert werden.
Transformierte Zellen können mit einer Reihe von Pflanzenhormonen wie Auxinen und Gibberellinen behandelt werden , und jede kann sich teilen und in die organisierten, spezialisierten Gewebezellen einer ganzen Pflanze differenzieren. Diese Fähigkeit zur totalen Regeneration wird Totipotenz genannt . Die neue Pflanze, die aus einer erfolgreich transformierten Zelle hervorgegangen ist, kann neue vererbbare Merkmale aufweisen. Die Verwendung der Genkanone kann der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens und seinem Ti-Plasmid zur Insertion von DNA in Pflanzenzellen gegenübergestellt werden. Siehe Transformation für verschiedene Transformationsmethoden bei verschiedenen Arten.
Menschen und andere Tiere
Genkanonen wurden auch verwendet, um DNA-Impfstoffe zu liefern .
Die Zufuhr von Plasmiden in Rattenneuronen durch die Verwendung einer Genkanone, insbesondere DRG-Neuronen, wird auch als pharmakologische Vorstufe bei der Untersuchung der Auswirkungen neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit verwendet .
Die Genkanone ist zu einem gängigen Werkzeug zum Markieren von Untergruppen von Zellen in kultiviertem Gewebe geworden. Neben der Fähigkeit, Zellen mit DNA-Plasmiden zu transfizieren, die für fluoreszierende Proteine kodieren, kann die Genkanone so angepasst werden, dass sie eine Vielzahl von lebenswichtigen Farbstoffen an Zellen liefert.
Als Alternative zur Mikroinjektion wurde auch der Genwaffenbeschuss zur Transformation von Caenorhabditis elegans eingesetzt .
Vorteile
Biolistik hat sich als vielseitige Methode der genetischen Veränderung erwiesen und wird im Allgemeinen bevorzugt, um transformationsresistente Nutzpflanzen wie Getreide zu entwickeln . Bemerkenswert ist , Bt - Mais ist ein Produkt von Biolistik. Die Plastidentransformation hat auch großen Erfolg mit Partikelbombardierung im Vergleich zu anderen gegenwärtigen Techniken, wie der Agrobacterium- vermittelten Transformation, die Schwierigkeiten haben, den Vektor gezielt auf den Chloroplasten zu richten und darin stabil zu exprimieren. Darüber hinaus gibt es keine Berichte über einen Chloroplasten, der ein Transgen, das mit einer Genkanone inseriert wurde, zum Schweigen bringt. Außerdem kann ein erfahrener Techniker mit nur einem Abfeuern einer Genkanone zwei transformierte Organismen erzeugen. Diese Technologie hat sogar die Modifikation spezifischer Gewebe in situ ermöglicht , obwohl dies wahrscheinlich eine große Anzahl von Zellen schädigt und nur einige und nicht alle Zellen des Gewebes transformiert .
Einschränkungen
Biolistics führt DNA zufällig in die Zielzellen ein. Somit kann die DNA in beliebige Genome, die in der Zelle vorhanden sind, transformiert werden, seien es nukleäre, mitochondriale, Plasmide oder andere, in jeder Kombination, obwohl ein geeignetes Konstruktdesign dies abschwächen kann. Die Abgabe und Integration mehrerer Matrizen des DNA-Konstrukts ist eine eindeutige Möglichkeit, was zu potentiell variablen Expressionsniveaus und Kopienzahlen des inserierten Gens führt. Dies ist auf die Fähigkeit der Konstrukte zurückzuführen, genetisches Material von anderen Konstrukten abzugeben und zu entnehmen, was dazu führt, dass einige kein Transgen tragen und andere mehrere Kopien tragen; die Anzahl der eingefügten Kopien hängt sowohl davon ab, wie viele Kopien des Transgens ein eingefügtes Konstrukt hat, als auch davon, wie viele eingefügt wurden. Da eukaryontische Konstrukte auf illegitimer Rekombination beruhen – einem Prozess, bei dem das Transgen ohne ähnliche genetische Sequenzen in das Genom integriert wird – und nicht auf homologe Rekombination , können sie nicht auf bestimmte Stellen innerhalb des Genoms gerichtet werden, es sei denn, das Transgen wird gemeinsam mit . geliefert Genome Editing Reagenzien.
Verweise
Weiterlesen
- O'Brien, J; Holt, M; Weißseite, G; Lummis, SC; Hastings, MH (2001). „Modifikationen an der tragbaren Gene Gun: Verbesserungen für die biolistische In-vitro-Transfektion von organotypischem neuronalem Gewebe“. Zeitschrift für neurowissenschaftliche Methoden . 112 (1): 57–64. doi : 10.1016/S0165-0270(01)00457-5 . PMID 11640958 . S2CID 30561105 .
Externe Links
- John O'Brien präsentiert...Gene Gun Barrels für weitere Informationen über Biolistik