Ti-Plasmid - Ti plasmid
Ein tumorinduzierendes (Ti) -Plasmid ist ein Plasmid, das in pathogenen Arten von Agrobacterium gefunden wird , einschließlich A. tumefaciens , A. rhizogenes , A. rubi und A. vitis .
Evolutionär ist das Ti-Plasmid Teil einer Familie von Plasmiden, die von vielen Arten von Alphaproteobakterien getragen werden . Mitglieder dieser Plasmidfamilie sind durch das Vorhandensein einer konservierten DNA-Region, bekannt als repABC -Genkassette, definiert, die die Replikation des Plasmids, die Aufteilung des Plasmids in Tochterzellen während der Zellteilung sowie die Aufrechterhaltung des Plasmids bei vermittelt niedrige Kopienzahlen in einer Zelle. Die Ti-Plasmide selbst werden nach der Art des Moleküls oder Opin in verschiedene Kategorien eingeteilt , sie ermöglichen den Bakterien, als Energiequelle abgebaut zu werden.
Die Anwesenheit dieses Ti-Plasmids ist für die Bakterien essentiell, um eine Kronengallenkrankheit in Pflanzen zu verursachen. Dies wird durch bestimmte entscheidende Regionen im Ti-Plasmid ermöglicht, einschließlich der vir- Region, die für Virulenzgene kodiert, und der Transfer-DNA (T-DNA)-Region, die ein Abschnitt des Ti-Plasmids ist , der durch Konjugation in die Wirtspflanze übertragen wird Zellen, nachdem eine Verletzungsstelle von den Bakterien erkannt wird. Diese Regionen haben Eigenschaften, die den Transport von T-DNA in Wirtspflanzenzellen ermöglichen und können die Wirtspflanzenzelle modifizieren, um die Synthese von Molekülen wie Pflanzenhormonen (zB Auxine , Cytokinine ) und Opine und die Bildung von Kronengallentumoren zu bewirken .
Da die T-DNA-Region des Ti-Plasmids von Bakterien auf Pflanzenzellen übertragen werden kann, stellte dies einen aufregenden Weg für den DNA-Transfer zwischen Königreichen dar und spornte umfangreiche Forschungen zum Ti-Plasmid und seinen möglichen Anwendungen in der Biotechnologie an.
Nomenklatur und Klassifikation
Das Ti-Plasmid ist ein Mitglied der RepABC-Plasmidfamilie, die in Alphaproteobakterien vorkommt. Diese Plasmide sind oft relativ groß und reichen von 100 kbp bis 2 Mbp. Sie werden auch oft als Replikons bezeichnet , da ihre Replikation an einer einzigen Stelle beginnt. Mitglieder dieser Familie haben eine charakteristische repABC -Genkassette. Ein weiteres bemerkenswertes Mitglied dieser Familie ist das wurzelinduzierende (Ri) -Plasmid , das von A. rhizogenes getragen wird , das eine andere Pflanzenkrankheit verursacht, die als Haarwurzelkrankheit bekannt ist.
Ein Schlüsselmerkmal von Ti-Plasmiden ist ihre Fähigkeit, die Produktion von Opinen, die Derivate verschiedener Aminosäuren oder Zuckerphosphate sind , in Wirtspflanzenzellen anzutreiben . Diese opines kann dann als ein Nährstoff für die infizierenden Bakterien verwendet werden, die katabolisiert die jeweiligen opines Gene unter Verwendung der in dem Ti - Plasmid kodiert wird .
Demgemäß wurden Ti - Plasmiden , basierend auf der Art des Opin klassifiziert sie katabolisieren, nämlich: nopaline- , octopine- oder mannityl-Typen, die Aminosäurederivate sind, oder agrocinopine-Typ, die Derivate von Zucker - Phosphat sind.
Historische Entdeckung
Die Identifizierung von A. tumefaciens als Verursacher von Gallentumoren bei Pflanzen ebnete den Weg für Einblicke in die molekularen Grundlagen der Kronengallenkrankheit.
Der erste Hinweis auf eine genetische Wirkung auf Wirtspflanzenzellen kam in den Jahren 1942-1943, als Pflanzenzellen von Sekundärtumoren keine Bakterienzellen enthielten. Diese Tumorzellen besaßen jedoch die Fähigkeit, Opine zu produzieren, die durch den infizierenden Bakterienstamm metabolisiert wurden. Entscheidend ist, dass die Produktion der jeweiligen Opine unabhängig von der Pflanzenart und gelegentlich nur innerhalb des Kronengallengewebes erfolgte, was darauf hindeutet, dass die Bakterien genetisches Material auf die Wirtspflanzenzellen übertragen hatten, um die Opinsynthese zu ermöglichen.
Wie und in welchem Umfang der DNA-Transfer stattfand, blieb jedoch eine offene Frage. Die Zugabe von A. tumefaciens- DNA allein verursachte keine Tumoren in Pflanzen, während sehr wenig A. tumefaciens- DNA in das Genom der Wirtspflanzenzelle integriert wurde. Auch die Zugabe von Desoxyribonukleasen (DNasen) zum Abbau von DNA konnte die Bildung und das Wachstum der Pflanzentumore nicht verhindern. Diese legten nahe, dass wenig, wenn überhaupt, DNA von A. tumefaciens auf die Wirtspflanzenzelle übertragen wird, um Krankheiten zu verursachen, und wenn DNA tatsächlich von den Bakterien auf die Pflanze übertragen wird, muss dies auf geschützte Weise erfolgen.
Anschließend wurde festgestellt, dass onkogene Bakterienstämme in der Lage sind, nicht-pathogene Bakterien durch Konjugation in Krankheitserreger umzuwandeln, wobei die für die Virulenz verantwortlichen Gene auf die nicht-pathogenen Zellen übertragen werden. Die Rolle eines Plasmids bei dieser pathogenen Fähigkeit wurde weiter unterstützt, als große Plasmide nur in pathogenen Bakterien, aber nicht in avirulenten Bakterien gefunden wurden. Schließlich wurde der Nachweis von Teilen bakterieller Plasmide in Wirtspflanzenzellen etabliert und bestätigt, dass dies das genetische Material ist, das für die genetische Wirkung der Infektion verantwortlich ist.
Mit der Identifizierung des Ti-Plasmids wurden viele Studien durchgeführt, um die Eigenschaften des Ti-Plasmids zu bestimmen und wie das genetische Material vom Agrobacterium auf den Pflanzenwirt übertragen wird. Einige bemerkenswerte frühe Meilensteine in der Untersuchung von Ti-Plasmiden umfassen die Kartierung eines Ti-Plasmids im Jahr 1978 und die Untersuchung der Sequenzähnlichkeit zwischen verschiedenen Ti-Plasmiden im Jahr 1981.
Zwischen 1980–2000 wurde auch die Charakterisierung der T-DNA-Region und der 'vir'-Region verfolgt. Studien in der T-DNA-Region bestimmten ihren Transferprozess und identifizierten Gene, die die Synthese von Pflanzenhormonen und Opinen ermöglichen. Unabhängig davon zielten frühe Arbeiten darauf ab, die Funktionen der Gene zu bestimmen, die in der 'vir'-Region kodiert sind - diese wurden grob in solche eingeteilt, die Bakterien-Wirt-Interaktionen ermöglichten, und solche, die die T-DNA-Lieferung ermöglichten.
Replikation, Partitionierung und Wartung
Die Replikation, Aufteilung und Aufrechterhaltung des Ti-Plasmids hängt von der repABC -Genkassette ab, die hauptsächlich aus drei Genen besteht: repA , repB und repC . repA und repB kodieren jeweils für Proteine, die an der Plasmidpartitionierung beteiligt sind, während repC für einen Replikationsinitiator kodiert. Diese Gene werden von 4 verschiedenen Promotoren exprimiert, die sich stromaufwärts von repA befinden . repE kodiert für eine kleine Antisense-RNA und befindet sich zwischen repB und repC . Zusätzlich sind innerhalb der repABC- Kassette eine Partitionierungsstelle ( parS ) und ein Replikationsursprung ( oriV ) vorhanden .
Replikation des Ti-Plasmids
Die Replikation des Ti-Plasmids wird durch das RepC-Initiatorprotein ( P05684 ) angetrieben , das zwei Proteindomänen besitzt : eine N-terminale Domäne (NTD), die an DNA bindet, und eine C-terminale Domäne (CTD). Mutationsanalysen haben gezeigt, dass das Ti-Plasmid ohne ein funktionsfähiges RepC-Protein nicht in der Lage ist, sich zu replizieren. Inzwischen ist die oriV- Sequenz etwa 150 Nukleotide lang und befindet sich im repC- Gen. Laborexperimente haben gezeigt, dass das RepC-Protein an diese Region bindet, was auf seine Rolle als Replikationsursprung hindeutet. Obwohl der vollständige Prozess hinter der Replikation des Ti-Plasmids nicht vollständig beschrieben wurde, würde daher der anfängliche Schritt der Replikation wahrscheinlich von der Expression von RepC und seiner Bindung an oriV abhängen . Bemerkenswert ist, dass das RepC-Protein nur in cis wirkt , wo es nur die Replikation des Plasmids antreibt, in dem es kodiert ist, und nicht irgendein anderes Plasmid, das auch in der Bakterienzelle vorhanden ist.
Partitionierung des Ti-Plasmids
| Komponente | Funktion |
|---|---|
| RepA (ParA), P05682 | Eine schwache ATPase , die die Expression der repABC- Kassette negativ autoreguliert und Filamente bilden kann, um die Aufteilung des Plasmids während der Zellteilung zu unterstützen |
| RepB (ParB), P05683 | Ein DNA-bindendes Protein, das als Adapter zwischen RepA und der parS- Stelle dient |
| parS | Die palindromische Bindungsstelle für das ParB-Protein; KonsensGTTNNCNGCNGNNAAC |
Das Aufteilungssystem des Ti-Plasmids ähnelt dem ParA/ParB-System, das in anderen Plasmiden und Bakterienchromosomen verwendet wird, und es wird angenommen, dass es auf die gleiche Weise wirkt. Mutationen in einem der Proteine RepA oder RepB haben zu einer Abnahme der Plasmidstabilität geführt, was ihre Rolle und Bedeutung bei der Plasmidpartitionierung anzeigt. Die Fähigkeit von RepA, Filamente zu bilden, ermöglicht es, eine physikalische Brücke zu bilden, entlang derer DNA zu den entgegengesetzten Polen einer sich teilenden Zelle gezogen werden kann. Währenddessen kann das RepB-Protein spezifisch an die parS- Sequenz binden und einen Komplex mit DNA bilden, der von RepA erkannt werden kann. Dieses System ist für die richtige Aufteilung des Ti-Plasmids besonders wichtig, da das Plasmid nur in wenigen Kopienzahlen in der Bakterienzelle vorhanden ist.
Erhaltung des Ti-Plasmids
Das Ti-Plasmid wird in einer Bakterienzelle bei niedrigen Kopienzahlen gehalten. Dies wird teilweise durch Beeinflussung der Expression des Replikationsinitiators RepC erreicht. Wenn es an ADP gebunden ist, wird RepA aktiviert, um mit RepB zu arbeiten und als negativer Regulator der repABC- Kassette zu wirken. Der RepC-Spiegel wird daher innerhalb einer Zelle niedrig gehalten, wodurch verhindert wird, dass während jedes Zellteilungszyklus zu viele Replikationsrunden stattfinden. Darüber hinaus gibt es eine kleine RNA, die als RepE bekannt ist und zwischen repB und repC kodiert ist und die Expression von repC verringert . RepE ist komplementär zu RepC und bindet mit der repC- mRNA , um ein doppelsträngiges Molekül zu bilden. Dies kann dann die translationale Produktion des RepC-Proteins blockieren.
Unabhängig davon wird die Expression der repABC- Kassette und damit die Kopienzahl des Ti-Plasmids auch über ein Quorum-Sensing- System in Agrobacterium beeinflusst . Quorum-Sensorsysteme reagieren auf die Dichte der Bakterienpopulation, indem sie ein als Autoinduktor bezeichnetes Molekül erkennen, das von den Bakterienzellen in geringen Mengen produziert wird und sich bei einer hohen Bakteriendichte bis zu einem Schwellenwert aufbauen würde. In diesem Fall ist der Autoinduktor das Molekül N-3-Oxooctanoyl-L-homoserinlacton (3-OC 8 -AHL), das von einem als TraR bekannten Regulator wahrgenommen wird. Bei Aktivierung bindet TraR an Regionen, die als Tra- Boxen in den Promotorregionen der repABC -Genkassette bekannt sind, um die Expression zu steuern . Daher erhöht eine hohe Populationsdichte die Anzahl der Plasmide, die in jeder Bakterienzelle vorhanden sind, was wahrscheinlich die Pathogenese im Pflanzenwirt unterstützt.
Merkmale
Virulenzoperon
Die Expression der vir- Region wird normalerweise unter normalen Bedingungen unterdrückt und wird nur aktiviert, wenn die Bakterien pflanzliche Signale von Wundstellen wahrnehmen. Diese Aktivierung ist für die Produktion von Vir-Proteinen und den Transfer von DNA und Proteinen in Wirtspflanzenzellen notwendig.
VirA und VirG bilden innerhalb von Agrobacterium ein zweikomponentiges regulatorisches System . Dies ist eine Art von Sensor- und Signalsystem, das häufig in Bakterien vorkommt; in diesem Fall wirken sie so, dass sie von Pflanzen stammende Signale wahrnehmen, um die Expression der vir- Region zu steuern . Während der Messung wird VirA, eine Histidinsensorkinase, phosphoryliert, bevor diese Phosphatgruppe an den Reaktionsregulator VirG weitergegeben wird. Der aktivierte Reaktionsregulator VirG kann dann an eine DNA-Region binden, die als vir- Box bekannt ist und sich stromaufwärts von jedem vir- Promotor befindet, um die Expression der vir- Region zu aktivieren . Eine mögliche nachgeschaltete Funktion des durch VirA und VirG vermittelten Sensings ist die gerichtete Bewegung oder Chemotaxis der Bakterien in Richtung von Pflanzen abgeleiteten Signalen; Dies ermöglicht es dem Agrobacterium , sich in Pflanzen zur Wundstelle zu bewegen. Darüber hinaus kann mit der Induktion der vir- Region der Transfer von T-DNA durch die Vir-Proteine vermittelt werden.
Das virB- Operon ist das größte Operon in der vir- Region und kodiert für 11 VirB-Proteine, die am Transferprozess von T-DNA und bakteriellen Proteinen in Wirtspflanzenzellen beteiligt sind (siehe Transferapparat unten).
Das virC- Operon kodiert für zwei Proteine: VirC1 und VirC2. Diese Proteine beeinflussen die Pathogenese des Agrobacteriums gegenüber verschiedenen Pflanzenwirten, und Mutationen können die Virulenz der Bakterien reduzieren, aber nicht beseitigen. Sowohl das virC- als auch das virD- Operon können durch ein chromosomal kodiertes Protein, das als Ros bekannt ist, reprimiert werden. Ros bindet an eine DNA-Region, die mit der Bindungsstelle des VirG-Regulators überlappt, und konkurriert daher mit VirG, um deren Expressionsniveau zu kontrollieren. Funktionell fördern VirC1 und VirC2 den Aufbau eines Relaxosomenkomplexes während des konjugativen Transfers von T-DNA von den Bakterien in die Wirtspflanzenzelle. Dies ist ein energieabhängiger Prozess, der über ihre NTPase-Aktivität vermittelt wird, und tritt auf, wenn sie an eine als Overdrive bekannte DNA-Region binden . Als Ergebnis erhöhen sie die Menge der produzierten T-DNA-Stränge. Nach der Herstellung des zu übertragenden DNA-Strangs (Transferstrang, T-Strang) können die VirC-Proteine auch helfen, den Transferstrang zum Transferapparat zu lenken.
Das virD- Operon kodiert für 4 Proteine: VirD1-D4. VirD1 und VirD2 sind an der Verarbeitung von T-DNA während der Konjugation zur Herstellung des T-Strangs beteiligt; Dies ist das einzelsträngige DNA-Molekül, das zur Wirtspflanzenzelle transportiert wird (siehe Transferapparat unten). Während der Verarbeitung fungiert VirD1 als Topoisomerase , um die DNA-Stränge abzuwickeln. VirD2, eine Relaxase , schneidet dann einen der DNA-Stränge und bleibt an die DNA gebunden, während sie auf die Empfängerzelle übertragen wird. Innerhalb der Empfängerzelle arbeitet VirD2 auch mit VirE2 zusammen, um die übertragene DNA zum Zellkern der Empfängerzelle zu leiten. Es gibt Hinweise darauf, dass VirD2 durch verschiedene Proteine phosphoryliert und dephosphoryliert werden kann, was seine Fähigkeit, DNA zu liefern, beeinträchtigt. Umgekehrt ist wenig über VirD3 bekannt, und Mutationsanalysen haben keine Unterstützung für seine Rolle bei der Virulenz von Agrobacterium geliefert . Schließlich ist VirD4 ein entscheidender Teil des Konjugationsprozesses und dient als Kopplungsfaktor, der den T-Strang erkennt und auf den Transportkanal überträgt.
Das virE- Operon kodiert für 2 Proteine: VirE1 und VirE2. VirE2 ist ein Effektorprotein, das zusammen mit dem T-Strang in Wirtspflanzenzellen transloziert wird. Dort bindet es an den T-Strang, um seine Abgabe an den Kern der Wirtspflanzenzelle zu lenken . Ein Teil dieser Aktivität beinhaltet das Vorhandensein von Kernlokalisierungssequenzen innerhalb des Proteins, die das Protein und die zugehörige DNA für den Eintritt in den Kern markieren. Es schützt auch den T-Strang vor Nukleaseangriffen . Es gibt einige Spekulationen über die Rolle von VirE2 als Proteinkanal, der es der DNA ermöglicht, sich durch die zytoplasmatische Membran der Pflanze zu bewegen . Andererseits kann VirE1 an der Förderung des Transfers des VirE2-Proteins in die Wirtspflanzenzelle beteiligt sein. Es bindet an die ssDNA-Bindungsdomäne von VirE2 und verhindert so, dass das VirE2-Protein vorzeitig an den T-Strang innerhalb der Bakterienzelle bindet.
virF ist ein Wirtsspezifitätsfaktor, der in einigen, aber nicht allen Arten von Ti-Plasmiden vorkommt; zum Beispiel besitzen Ti-Plasmide vom Octopin-Typ virF, aber Nopalin-Typen nicht. Die Fähigkeit von A. tumefaciens , bei bestimmten Pflanzenarten, aber nicht bei anderen, Kronengallentumore zu induzieren, wurde dem Vorhandensein oder Fehlen dieses virF- Gens zugeschrieben.
Das virH- Operon kodiert für 2 Proteine: VirH1 und VirH2. Eine bioinformatische Studie der Aminosäuresequenzen des VirH-Proteins zeigte Ähnlichkeiten zwischen ihnen und einer Superfamilie von Proteinen, die als Cytochrom-P450- Enzyme bekannt sind. Es wurde dann entdeckt, dass VirH2 bestimmte phenolische Verbindungen, die von VirA entdeckt wurden, metabolisiert.
Transfer-DNA (T-DNA)
Die T-DNA von Agrobacterium hat eine Länge von ungefähr 15-20 kbp und wird bei ihrem Transfer über einen als Rekombination bekannten Prozess in das Wirtspflanzengenom integriert . Dieser Prozess nutzt bereits vorhandene Lücken im Genom der Wirtspflanzenzelle, damit sich die T-DNA mit kurzen Sequenzen im Genom paaren kann , wodurch der Prozess der DNA-Ligation eingeleitet wird , bei dem die T-DNA dauerhaft mit dem Pflanzengenom verbunden ist. Die T-DNA-Region wird an beiden Enden von 24-bp-Sequenzen flankiert.
Innerhalb des Genoms der Wirtspflanzenzelle wird die T-DNA von Agrobacterium exprimiert, um zwei Hauptgruppen von Proteinen zu produzieren. Eine Gruppe ist für die Produktion von Pflanzenwachstumshormonen verantwortlich. Durch die Produktion dieser Hormone kommt es zu einer erhöhten Zellteilungsrate und damit zur Bildung von Kronengallentumoren. Die zweite Gruppe von Proteinen ist für die Steuerung der Opinsynthese in den Wirtspflanzenzellen verantwortlich. Die produzierten spezifischen Opine hängen vom Typ des Ti-Plasmids ab, jedoch nicht vom Pflanzenwirt. Diese Opine können vom Pflanzenwirt nicht verwertet werden und werden stattdessen aus der Pflanzenzelle exportiert, wo sie von den Agrobacterium- Zellen aufgenommen werden können. Die Bakterien besitzen Gene in anderen Regionen des Ti-Plasmids, die den Abbau von Opinen ermöglichen.
Transfergerät
Innerhalb des Ti-Plasmids kodierte Transferapparate müssen zwei Ziele erreichen: den konjugativen Transfer des Ti-Plasmids zwischen Bakterien ermöglichen und den Transport der T-DNA und bestimmter Effektorproteine in Wirtspflanzenzellen ermöglichen. Diese werden durch das Tra/Trb-System bzw. das VirB/VirD4-System erreicht, die Mitglieder des Typ-IV-Sekretionssystems (T4SS) sind.
Damit das Ti-Plasmid und die T-DNA durch Konjugation übertragen werden können, müssen sie zunächst von verschiedenen Proteinen wie dem Relaxase-Enzym (TraA/VirD2) und den DNA-Transfer- und Replikationsproteinen (Dtr) verarbeitet werden. Zusammen werden diese Proteine eine als Transferursprung ( oriT ) bekannte Region im Ti-Plasmid erkennen und daran binden , um den Relaxosomenkomplex zu bilden. Für die T-DNA wird ein Nick an der Grenzsequenz der T-DNA erzeugt und der geknickte T-Strang wird zur Zellmembran transportiert, wo der Rest der Transfermaschinerie vorhanden ist.
Innerhalb des VirB/VirD4-Systems wird die VirD2-Relaxase von den akzessorischen Faktoren VirD1, VirC1 und VirC2 unterstützt, während sie das DNA-Substrat verarbeitet. Darüber hinaus tragen die VirD2-Relaxase und die VirC-Proteine zur Abgabe des DNA-Strangs an den VirD4-Rezeptor an der Zellmembran bei. Dieser Rezeptor ist ein wesentlicher Bestandteil von T4SSs und soll den Transfer der DNA in den Translokationskanal zwischen zwei Zellen anregen und vermitteln. Die folgende Tabelle fasst die im virB- Operon kodierten Proteine zusammen , die den Translokationskanal des VirB/VirD4-Systems bilden.
| Protein(e) | Funktion |
|---|---|
| VirB4, VirB11 | ATPasen, die die Energie für den DNA-Transfer liefern |
| VirB3, VirB6, VirB8 | Untereinheiten einer mutmaßlichen Translocase der inneren Membran |
| VirB7, VirB9, VirB10 | Bildet einen Kernkomplex, der die Kanaluntereinheiten stabilisiert |
| VirB2 | Die Haupt- Pilin- Untereinheit des konjugativen Pilus |
| VirB1, VirB5 | Nebenkomponenten des konjugativen Pilus |
Anwendungen in der Biotechnik
Die Fähigkeit von Agrobacterium , DNA in Pflanzenzellen zu transportieren, öffnete neue Türen für das Pflanzengenom- Engineering und ermöglichte die Produktion genetisch veränderter Pflanzen (transgene Pflanzen). Proteine, die an der Vermittlung des T-DNA-Transfers beteiligt sind, erkennen zuerst die Grenzsequenzen der T-DNA-Region. Daher ist es Wissenschaftlern möglich, T-DNA-Grenzsequenzen zu verwenden, um jede gewünschte Sequenz von Interesse zu flankieren – ein solches Produkt kann dann in ein Plasmid eingefügt und in Agrobacterium- Zellen eingeführt werden. Dort werden die Border-Sequenzen vom Transferapparat von A. tumefaciens erkannt und standardmäßig in die Zielpflanzenzelle eingebracht. Darüber hinaus editiert das resultierende Produkt das Pflanzengenom, indem es nur die Randsequenzen der T-DNA zurücklässt, ohne irgendwelche Tumoren in Pflanzen zu verursachen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um verschiedene Kulturpflanzen zu modifizieren, einschließlich Reis, Gerste und Weizen. Weitere Arbeiten haben seitdem die Ziele von A. tumefaciens auf Pilze und menschliche Zelllinien ausgeweitet .