Vektor (Molekularbiologie) - Vector (molecular biology)

Für andere Verwendungen siehe Vector .

Beim molekularen Klonen ist ein Vektor ein DNA-Molekül, das als Vehikel verwendet wird, um fremdes genetisches Material künstlich in eine andere Zelle zu transportieren , wo es repliziert und/oder exprimiert werden kann (zB Plasmid , Cosmid , Lambda-Phagen ). Ein Vektor, der fremde DNA enthält, wird als rekombinante DNA bezeichnet . Die vier Haupttypen von Vektoren sind Plasmide , virale Vektoren , Cosmide und künstliche Chromosomen . Von diesen sind die am häufigsten verwendeten Vektoren Plasmide. Allen gentechnisch veränderten Vektoren gemeinsam ist ein Replikationsursprung , eine Multiklonierungsstelle und ein selektierbarer Marker .

Der Vektor selbst ist im Allgemeinen eine DNA- Sequenz, die aus einem Insert ( Transgen ) und einer größeren Sequenz besteht, die als "Rückgrat" des Vektors dient. Der Zweck eines Vektors, der genetische Information auf eine andere Zelle überträgt, besteht typischerweise darin, das Insert in der Zielzelle zu isolieren, zu vermehren oder zu exprimieren. Alle Vektoren können für die Klonierung verwendet werden und sind daher Klonierungsvektoren , aber es gibt auch Vektoren, die speziell für die Klonierung entworfen wurden, während andere speziell für andere Zwecke, wie Transkription und Proteinexpression, entworfen werden können. Vektoren, die speziell für die Expression des Transgens in der Zielzelle entworfen wurden, werden Expressionsvektoren genannt und weisen im Allgemeinen eine Promotorsequenz auf , die die Expression des Transgens steuert. Einfachere Vektoren, die als Transkriptionsvektoren bezeichnet werden, können nur transkribiert, aber nicht translatiert werden: Sie können in einer Zielzelle repliziert, aber nicht exprimiert werden, im Gegensatz zu Expressionsvektoren. Transkriptionsvektoren werden verwendet, um ihr Insert zu amplifizieren.

Die Manipulation von DNA wird normalerweise an E. coli- Vektoren durchgeführt, die Elemente enthalten, die für ihre Aufrechterhaltung in E. coli notwendig sind . Vektoren können jedoch auch Elemente aufweisen, die es ihnen ermöglichen, in einem anderen Organismus wie Hefe-, Pflanzen- oder Säugerzellen gehalten zu werden, und diese Vektoren werden Shuttle-Vektoren genannt . Solche Vektoren weisen bakterielle oder virale Elemente auf, die auf den nicht-bakteriellen Wirtsorganismus übertragen werden können, jedoch wurden auch andere Vektoren, die als intragene Vektoren bezeichnet werden, entwickelt, um die Übertragung jeglichen genetischen Materials von einer fremden Spezies zu vermeiden.

Die Insertion eines Vektors in die Zielzelle wird bei Bakterienzellen üblicherweise als Transformation bezeichnet, bei eukaryontischen Zellen als Transfektion , obwohl die Insertion eines viralen Vektors oft als Transduktion bezeichnet wird .

Eigenschaften

Plasmide

Hauptartikel: Plasmidvektor

Plasmide sind doppelsträngige extrachromosomale und im Allgemeinen zirkuläre DNA-Sequenzen, die unter Verwendung der Replikationsmaschinerie der Wirtszelle replizieren können. Plasmidvektoren bestehen minimalistisch aus einem Replikationsursprung , der eine halbunabhängige Replikation des Plasmids im Wirt ermöglicht. Plasmide sind in vielen Bakterien weit verbreitet, beispielsweise in Escherichia coli , aber auch in einigen Eukaryoten, beispielsweise in Hefen wie Saccharomyces cerevisiae . Bakterielle Plasmide können konjugativ/übertragbar und nicht-konjugativ sein:

  • konjugativ - vermittelt DNA-Transfer durch Konjugation und verbreitet sich daher schnell unter den Bakterienzellen einer Population; zB F-Plasmid, viele R- und einige Col-Plasmide.
  • nicht konjugativ – vermitteln keine DNA durch Konjugation, zB viele R- und col-Plasmide.
Das Plasmid pBR322 ist eines der ersten Plasmide, das weit verbreitet als Klonierungsvektor verwendet wird .

Plasmide mit speziell konstruierten Merkmalen werden im Labor häufig zu Klonierungszwecken verwendet . Diese Plasmide sind im Allgemeinen nicht-konjugativ, können jedoch viele weitere Merkmale aufweisen, insbesondere eine " Mehrfachklonierungsstelle ", wo mehrere Restriktionsenzym- Spaltungsstellen die Insertion eines Transgen-Inserts ermöglichen. Die Bakterien, die die Plasmide enthalten, können innerhalb von Stunden Millionen von Kopien des Vektors innerhalb der Bakterien erzeugen, und die amplifizierten Vektoren können zur weiteren Manipulation aus den Bakterien extrahiert werden. Plasmide können spezifisch als Transkriptionsvektoren verwendet werden und solchen Plasmiden können entscheidende Sequenzen für die Proteinexpression fehlen. Für die Proteinexpression verwendete Plasmide, die als Expressionsvektoren bezeichnet werden , würden Elemente für die Translation von Proteinen, wie eine Ribosomenbindungsstelle , Start- und Stoppcodons, einschließen .

Virale Vektoren

Hauptartikel: Viraler Vektor

Virale Vektoren sind im Allgemeinen gentechnisch veränderte Viren, die modifizierte virale DNA oder RNA tragen, die nicht infektiös gemacht wurde, aber immer noch virale Promotoren und auch das Transgen enthalten, wodurch die Translation des Transgens durch einen viralen Promotor ermöglicht wird. Da viralen Vektoren jedoch häufig infektiöse Sequenzen fehlen, benötigen sie für eine groß angelegte Transfektion Helferviren oder Verpackungslinien. Virale Vektoren werden oft für den dauerhaften Einbau des Inserts in das Wirtsgenom entworfen und hinterlassen daher nach dem Einbau des Transgens unterschiedliche genetische Marker im Wirtsgenom. Retroviren hinterlassen beispielsweise nach der Insertion ein charakteristisches retrovirales Integrationsmuster , das nachweisbar ist und anzeigt, dass der virale Vektor in das Wirtsgenom eingebaut wurde.

Künstliche Chromosomen

Hauptartikel: Künstliches Chromosom (Begriffsklärung)

Künstliche Chromosomen sind hergestellte Chromosomen im Zusammenhang mit künstlichen Hefechromosomen (YACs) , bakteriellen künstlichen Chromosomen (BACs) oder menschlichen künstlichen Chromosomen (HACs). Ein künstliches Chromosom kann ein viel größeres DNA-Fragment tragen als andere Vektoren. YACs und BACs können ein bis zu 300.000 Nukleotide langes DNA-Fragment tragen. Drei strukturelle Notwendigkeiten eines künstlichen Chromosoms umfassen einen Replikationsursprung, ein Zentromer und telomerische Endsequenzen.

Transkription

Die Transkription des klonierten Gens ist eine notwendige Komponente des Vektors, wenn die Expression des Gens erforderlich ist: Ein Gen kann durch Transkription amplifiziert werden, um mehrere Kopien von mRNAs zu erzeugen , der Matrize, auf der das Protein durch Translation produziert werden kann. Eine größere Anzahl von mRNAs würde eine größere Proteinmenge exprimieren, und wie viele Kopien der mRNA erzeugt werden, hängt von dem im Vektor verwendeten Promotor ab. Die Expression kann konstitutiv sein, was bedeutet, dass das Protein ständig im Hintergrund produziert wird, oder sie kann induzierbar sein, wobei das Protein nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert wird, beispielsweise wenn ein chemischer Induktor hinzugefügt wird. Diese beiden unterschiedlichen Expressionstypen hängen von den verwendeten Promotor- und Operatortypen ab .

Virale Promotoren werden häufig zur konstitutiven Expression in Plasmiden und in viralen Vektoren verwendet, da sie normalerweise eine konstante Transkription in vielen Zelllinien und -typen zuverlässig erzwingen. Die induzierbare Expression hängt von Promotoren ab, die auf die Induktionsbedingungen ansprechen: Beispielsweise initiiert der Maus-Mammatumorvirus- Promotor die Transkription erst nach Dexamethason- Applikation und der Drosophilia- Hitzeschock-Promotor nur nach hohen Temperaturen.

Einige Vektoren sind nur für die Transkription bestimmt, zum Beispiel für die in vitro- mRNA-Produktion. Diese Vektoren werden Transkriptionsvektoren genannt. Ihnen können die für die Polyadenylierung und Termination notwendigen Sequenzen fehlen, daher dürfen sie nicht für die Proteinproduktion verwendet werden.

Ausdruck

Hauptartikel: Expressionsvektor

Expressionsvektoren produzieren Proteine ​​durch die Transkription des Inserts des Vektors, gefolgt von der Translation der produzierten mRNA , sie benötigen daher mehr Komponenten als die einfacheren reinen Transkriptionsvektoren. Die Expression in unterschiedlichen Wirtsorganismen würde unterschiedliche Elemente erfordern, obwohl sie ähnliche Anforderungen teilen, beispielsweise einen Promotor für die Transkriptionsinitiation, eine ribosomale Bindungsstelle für die Translationsinitiation und Terminationssignale.

Prokaryoten-Expressionsvektor

  • Promotor – üblicherweise verwendete induzierbare Promotoren sind Promotoren, die vom lac- Operon und dem T7- Promotor abgeleitet sind. Andere verwendete starke Promotoren umfassen den Trp-Promotor und den Tac-Promotor , die ein Hybrid sowohl des Trp- als auch des Lac-Operon-Promotors sind.
  • Ribosomenbindungsstelle (RBS) – folgt dem Promotor und fördert die effiziente Translation des interessierenden Proteins.
  • Translationsinitiationsstelle – Shine-Dalgarno-Sequenz, eingeschlossen in die RBS, 8 Basenpaare stromaufwärts des AUG-Startcodons.

Expressionsvektor der Eukaryoten

Eukaryotische Expressionsvektoren erfordern Sequenzen, die codieren für:

  • Polyadenylierungsschwanz : Erzeugt einen Polyadenylierungsschwanz am Ende der transkribierten prä-mRNA, der die mRNA vor Exonukleasen schützt und die Transkriptions- und Translationstermination sicherstellt: stabilisiert die mRNA-Produktion.
  • Minimale UTR- Länge: UTRs enthalten spezifische Eigenschaften, die die Transkription oder Translation behindern können, und daher werden die kürzesten UTRs oder überhaupt keine in optimalen Expressionsvektoren kodiert.
  • Kozak-Sequenz : Vektoren sollten für eine Kozak-Sequenz in der mRNA kodieren, die das Ribosom für die Translation der mRNA zusammenbaut.

Merkmale

Moderne künstlich konstruierte Vektoren enthalten wesentliche Komponenten, die in allen Vektoren zu finden sind, und können andere zusätzliche Merkmale enthalten, die nur in einigen Vektoren zu finden sind:

  • Replikationsursprung : Notwendig für die Replikation und Aufrechterhaltung des Vektors in der Wirtszelle.
  • Promotor : Promotoren werden verwendet, um die Transkription des Transgens des Vektors sowie der anderen Gene im Vektor, wie beispielsweise des Antibiotikaresistenzgens, voranzutreiben. Einige Klonierungsvektoren brauchen keinen Promotor für das klonierte Insert zu haben, aber dieser ist ein wesentlicher Bestandteil von Expressionsvektoren, damit das klonierte Produkt exprimiert werden kann.
  • Klonierungsstelle: Dies kann eine multiple Klonierungsstelle oder andere Merkmale sein, die die Insertion von Fremd-DNA in den Vektor durch Ligation ermöglichen .
  • Genetische Marker : Genetische Marker für virale Vektoren ermöglichen die Bestätigung, dass der Vektor in die genomische DNA des Wirts integriert wurde.
  • Antibiotikaresistenz : Vektoren mit antibiotikaresistenten offenen Leserastern ermöglichen das Überleben von Zellen, die den Vektor in antibiotikahaltigen Wachstumsmedien durch Antibiotika-Selektion aufgenommen haben.
  • Epitop : Einige Vektoren können eine Sequenz für ein spezifisches Epitop enthalten, das in das exprimierte Protein eingebaut werden kann. Es ermöglicht die Antikörperidentifizierung von Zellen, die das Zielprotein exprimieren.
  • Reportergene : Einige Vektoren können ein Reportergen enthalten, das die Identifizierung eines Plasmids ermöglicht, das eine inserierte DNA-Sequenz enthält. Ein Beispiel ist lacZ-α, das für das N-Terminus-Fragment von β-Galactosidase kodiert , einem Enzym, das Galaktose verdaut . Innerhalb von lacZ-α befindet sich eine multiple Klonierungsstelle , und ein erfolgreich in den Vektor ligiertes Insert unterbricht die Gensequenz, was zu einer inaktiven β-Galactosidase führt. Zellen, die einen Vektor mit einem Insert enthalten, können unter Verwendung einer Blau/Weiß-Selektion identifiziert werden, indem Zellen in Medien wachsen gelassen werden, die ein Galactose- Analogon ( X-gal ) enthalten. Zellen, die β-Galactosidase exprimieren (enthalten daher kein Insert) erscheinen als blaue Kolonien. Weiße Kolonien würden als solche ausgewählt, die ein Insert enthalten können. Andere häufig verwendete Reporter umfassen grün fluoreszierendes Protein und Luciferase .
  • Targeting-Sequenz: Expressionsvektoren können das Codieren für eine Targeting-Sequenz im fertigen Protein umfassen, die das exprimierte Protein zu einer spezifischen Organelle in der Zelle oder einem spezifischen Ort wie dem periplasmatischen Raum von Bakterien lenkt .
  • Proteinreinigungs-Tags : Einige Expressionsvektoren umfassen Proteine ​​oder Peptidsequenzen, die eine leichtere Reinigung des exprimierten Proteins ermöglichen. Beispiele umfassen Polyhistidin-Tag , Glutathion-S-Transferase und Maltose-bindendes Protein . Einige dieser Tags können auch eine erhöhte Löslichkeit des Zielproteins ermöglichen. Das Zielprotein ist mit dem Protein-Tag fusioniert, aber eine Protease-Spaltungsstelle, die in der Polypeptid-Linker-Region zwischen dem Protein und dem Tag positioniert ist, ermöglicht die spätere Entfernung des Tags.

Siehe auch

Verweise

Weiterlesen

  • Freshney IR (2005-07-29). Kultur tierischer Zellen: Ein Handbuch der grundlegenden Technik . Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-45329-1.

Externe Links